氢氧化铝–壳聚糖–皂苷佐剂吸附的 Salmonella Gallinarum 与 Pasteurella multocida 二价灭活单剂疫苗在 Swiss 小鼠中诱导完全保护

《Vaccines》：Combined Salmonella and Pasteurella multocida Antigens Single-Dose and Adsorbed in Aluminum Hydroxide–Chitosan Protect Swiss Mice Against Lethal Challenge

　　

背景/目的：禽霍乱和禽伤寒是家禽产业中的主要细菌性疾病，可导致生产性能下降和经济损失。本研究开发了一种单剂二价灭活疫苗。方法：研究人员在 Swiss 小鼠中评价了含 Pasteurella multocida（P. multocida）和 Salmonella Gallinarum（S. Gallinarum）抗原、吸附于基于壳聚糖、氢氧化铝和皂苷的水性基质的实验疫苗不同浓度，以确定最佳单剂浓度。结果：疫苗效力通过存活率评估；实验疫苗提供完全保护，而用商品化疫苗接种的动物中67%在攻击后存活，攻击剂量为1 × 10¹⁰ CFU/mL（2 × 10⁹ CFU/小鼠）的 P. multocida 和5 × 10¹⁰ CFU/mL（1 × 10¹⁰ CFU/小鼠）的 S. Gallinarum。随后，研究人员开展实验以确定免疫实验疫苗（单剂 vs. 双剂方案）并在攻击后动物的细胞因子谱。攻击前细胞因子分析显示，各组间白介素（IL）-2、IL-4、IL-10、IL-17、干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）谱相似；然而，单剂实验疫苗组（G1）的IL-6水平显著高于商品化疫苗组（G2）。在攻击后比较研究中，单剂疫苗诱导的细胞因子反应强健且稳定，在 S. Gallinarum 攻击后未显示负干扰，尽管双剂方案确实增强了针对 S. Gallinarum 的细胞和调节性细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-10）。相反，对于 P. multocida 攻击组或未攻击组，各处理间细胞因子谱未观察到显著差异。结论：单剂方案足以赋予针对两种病原体的完全保护性免疫，提示其是同时预防禽伤寒和禽霍乱的有前景策略。

研究背景与目的：禽霍乱由 Pasteurella multocida 引起，禽伤寒由 Salmonella enterica serovar Gallinarum biovar Gallinarum（S. Gallinarum）引起，二者均对家禽产业造成显著经济损失并影响国际贸易。活疫苗存在毒力返强和免疫抑制动物严重反应的风险；灭活疫苗虽可规避复制能力相关风险，但商品化灭活疫苗在免疫应答广度和持续时间上仍有局限。佐剂可增强免疫原性、延长应答、刺激细胞和体液免疫并降低联合疫苗中的抗原竞争。壳聚糖具有黏膜黏附性并促进抗原与免疫细胞相互作用，皂苷可同时刺激细胞和体液应答，氢氧化铝主要诱导Th2型应答。基于此，研究人员构建含灭活 S. Gallinarum 和 P. multocida 抗原、吸附于壳聚糖-氢氧化铝-皂苷基质的实验疫苗，在小鼠模型中评价其增强免疫和延长保护的能力，目标是为家禽减少重复接种操作、优化免疫程序提供依据。研究得出单剂实验疫苗对两种病原体致死攻击提供完全保护，优于需两剂的商品化疫苗；单剂足以激活完全保护所需免疫机制；250 μL剂量保护最佳且不影响增重；壳聚糖、氢氧化铝和皂苷组合是有前景的佐剂平台，但需在靶动物中进一步研究。

关键技术方法：雌性 Swiss 小鼠（约6周龄，20–24 g）来源 Federal University of Goiás（UFG），饲养于 Federal University of Tocantins（UFT）的 LaBVac；P. multocida type A 来自 Federal University of Rio Grande do Sul（UFRGS），S. Gallinarum 来自 State University of Londrina（UEL）。按 Reed and Muench 法测定半数致死量（LD₅₀，median lethal dose）；甲醛灭活抗原后制备壳聚糖-氢氧化铝-皂苷佐剂疫苗；比较疫苗剂量、单剂实验疫苗与两剂商品化疫苗及对照；腹腔攻击后以 Kaplan–Meier/log-rank 分析生存率，双因素方差分析（ANOVA，analysis of variance）比较体重和细胞因子；用 Cytometric Bead Array（CBA，微球阵列）流式检测 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α 和 IFN-γ。

研究结果：3.1 小鼠模型中 S. Gallinarum 与 P. multocida 致死剂量的确定：通过腹腔接种不同浓度菌液并监测48 h，P. multocida 在7.5×10¹³–2.17×10¹¹ CFU/mL 导致急性病程和100%死亡，≤1.16×10¹⁰ CFU/mL 有存活，确定致死感染剂量为95 LD₅₀（1×10¹⁰ CFU/mL；2×10⁹ CFU/小鼠）；S. Gallinarum 1.37×10¹⁵ CFU/mL 组12 h内全部死亡，剂量降低存活率升高，确定致死感染剂量为40 LD₅₀（5×10¹⁰ CFU/mL；1×10¹⁰ CFU/小鼠）。3.2 小鼠模型中疫苗剂量的评价：通过比较250、125、50 μL单剂和磷酸盐缓冲液（PBS，phosphate-buffered saline）对照，21天体重无显著增重变化，仅GC2与对照差异，因非剂量依赖而归因于个体生物学变异；P. multocida攻击后GC1、GC2、GC3存活率分别为100%、83%、67%（p<0.05）；S. Gallinarum攻击后分别为83%、33%、33%（p<0.05）。随后比较单剂实验疫苗、两剂商品化疫苗、佐剂和PBS，免疫后21天攻击，实验疫苗对两种菌攻击均100%存活，商品化疫苗67%，佐剂17%，PBS 0（p<0.05）。3.3 实验疫苗与商品化疫苗免疫、攻击及未攻击小鼠细胞因子谱：通过CBA检测，攻击前G1与G2的IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α相似，G1的IL-6显著高于G2（p<0.05）。单剂免疫后P. multocida（G3）或S. Gallinarum（G4）攻击，多数细胞因子无显著差异；免疫未攻击组IL-6显著高于G3；S. Gallinarum攻击未干扰攻击前后细胞因子刺激。单剂与双剂实验疫苗比较，二者攻击后均100%存活；S. Gallinarum攻击后双剂组IFN-γ、TNF-α、IL-10显著高于单剂组（p<0.05），P. multocida攻击组无显著差异。

讨论部分总结：灭活疫苗可同时暴露多种抗原、提高管理效率，但可能免疫应答较弱，需佐剂增强。本实验疫苗在小鼠中完全保护并优于需两剂的商品化疫苗；肌肉接种可能促进局部抗原滞留和抗原提呈细胞募集，腹腔攻击模拟全身播散，使系统免疫保护具有生物学相关性。双剂实验疫苗后S. Gallinarum攻击组IFN-γ、TNF-α升高，可能涉及辅助性T细胞1（Th1）相关机制，但原文强调未检测抗原特异性抗体滴度和细胞免疫表型，解释需谨慎；IL-17未见Th17参与确认且每组n=3，需扩大样本；双剂组IL-10高于单剂组提示更强免疫调节。单剂组尽管攻击后细胞因子无显著变化，仍达100%保护，原文认为这提示单剂已建立足够保护性免疫，无需强烈系统炎症激活，细胞因子稳定不代表无应答，而是有效控制感染且炎症成本较低；单剂方案可减少动物应激、操作成本和多剂程序导致的覆盖失败。P. multocida为 predominantly extracellular pathogen，其免疫应答与体液免疫一致，但同样需抗体滴度验证。未攻击G1基础IL-6较高归因于壳聚糖-氢氧化铝-皂苷佐剂的免疫刺激潜力，与Zhao et al. (2009)结果一致。研究局限包括未检测抗原特异性抗体和细胞免疫表型，小鼠模型与禽类细胞因子生物学存在差异，需在靶动物中进一步研究。

研究结论（翻译）：结果提示，本研究开发的单剂二价灭活疫苗在小鼠模型中对 S. Gallinarum 和 P. multocida 攻击具有高保护效力，使免疫动物获得100%存活。尽管两剂方案在 S. Gallinarum 攻击后增加了细胞和调节性细胞因子，单剂免疫足以激活完全保护所需的免疫机制。在所评价的配方中，250 μL剂量表现出最佳保护性能和良好安全性，不影响动物增重。综上，数据突出壳聚糖、氢氧化铝和皂苷组合作为有前景佐剂平台的潜力，为未来在目标禽类中的研究提供基础，这是桥接模型间免疫学差异的必要步骤。