《Diagnostics》：Comprehensive Analysis of Next-Generation Sequencing and ARMS-PCR for Detecting EGFR S768 Mutations in Chinese Non-Small Cell Lung Cancer Patients
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背景： 准确检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EGFR S768位点突变对于选择适当的治疗方案至关重要。本研究比较了二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）与扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（amplificatio
摘要专业翻译
背景： 准确检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EGFR S768位点突变对于选择适当的治疗方案至关重要。本研究比较了二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）与扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）在中国NSCLC患者中检测EGFR S768突变的效果。方法： 本研究回顾性分析了20,731例分子病理检测结果（其中8,345例采用NGS，12,386例采用ARMS-PCR）。结果： ARMS-PCR检测EGFR S768变异体的检出率显著低于NGS（0.40% vs. 1.15%，p < 0.001）。ARMS-PCR检出的变异体以S768I为主，而NGS识别出更广泛的变异谱，包括S768I、S768_D770dup、S768_V769delinsIL及S768_V769insLDS。此外，EGFR S768I突变常与其他EGFR突变共存，而S768位点或其附近的插入突变很少与其他EGFR突变共存（95.08% vs. 3.03%，p < 0.001）。值得注意的是，NGS检出的3例S768_V769delinsIL或V769_D770insSVV病例被ARMS-PCR鉴定为S768I，这可能影响患者治疗方案的选择。序列变异如c.2307_2308insAGCGTGGTG、c.2303_2305delinsTCT和c.2303_2305delinsTTT可能是ARMS-PCR与NGS结果不一致的原因，这归因于可能的引物非特异性结合。然而，这仍是基于序列比较的假设，需要进一步的实验验证。结论： EGFR S768位点周围的复杂突变或插入可能导致ARMS-PCR与NGS结果不一致。当患者在EGFR S768I导向的靶向治疗期间出现快速疾病进展时，建议采用NGS确认EGFR S768变异体。
论文解读文章
一、研究背景与意义
肺癌仍是全球癌症负担的首要原因。根据2022年全球癌症统计数据，肺癌约占新发病例250万例（占所有癌症诊断的12.4%），死亡约180万例（占总癌症死亡率的18.7%）。中国的情况更为严峻，全国报告新发病例1,060,600例（占所有新发恶性肿瘤病例的22.0%），死亡733,300例（占所有恶性肿瘤死亡的28.5%）。约85%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC），表皮生长因子受体（EGFR）是关键的驱动基因。在中国晚期肺癌患者中，EGFR突变率高达55.9%。EGFR第18–21外显子的突变，最常见的是19外显子缺失（ex19_del，占40–45%）和L858R（占35–40%），可预测口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的敏感性。
值得注意的是，EGFR第20外显子的不同突变位点和类型表现出不同的药物反应，使其成为异质性亚组。例如，S768I错义突变和S768位点附近的插入突变通过完全不同的机制影响EGFR功能。EGFR S768I是一种αC-β4环突变，诱导αC-螺旋构象改变，被归类为P-loop和αC-螺旋压缩（PACC）亚类。S768I突变通过变构调节机制增强αC-螺旋的稳定性，从而促进EGFR激活。相比之下，EGFR S768位点的插入突变（一种外显子20插入类型，ex20ins），最常见的是S768_D770dup，通常发生在αC-螺旋之后的环区，在C-螺旋末端形成“楔形”，有效锁定螺旋向内活性构象并产生空间位阻，阻碍多种TKI的结合。因此，S768I和邻近的ex20ins通过不同机制改变EGFR结构，导致不同的治疗反应。S768I对第二代TKI（如阿法替尼）敏感，而大多数EGFR ex20ins突变对第一代和第二代TKI表现出原发性耐药。目前，对于EGFR ex20ins的NSCLC患者，美国食品药品监督管理局（FDA）和国家药品监督管理局（NMPA）均推荐amivantamab联合化疗（卡铂/培美曲塞）作为一线治疗；同时，sunvozertinib在相关临床试验中也显示出良好疗效，并于2025年7月前已获NMPA和FDA批准。因此，精确识别S768变异体对于指导靶向治疗具有重要的临床意义。
PCR和NGS是检测NSCLC患者EGFR S768位点变异的两种主要方法。与NGS相比，PCR具有检测周期短、成本低的优势，但其对EGFR第20外显子突变的检测能力有限。多项研究报道PCR检测EGFR ex20ins突变时漏检常见，其检出率显著低于NGS。此外，PCR对S768I的假阳性风险更值得临床关注。一项研究报告NGS确认了六例qPCR检测的EGFR S768I变异中五例为假阳性。这些发现表明PCR不仅存在漏检风险，在检测EGFR S768I时也存在特异性缺陷。然而，广泛用于中国NSCLC患者的扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ARMS-PCR）系统在EGFR S768突变上的性能尚未得到充分研究。
二、研究设计与技术方法
研究人员开展了一项回顾性研究，分析了2011年8月至2025年10月期间华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科20,731例NSCLC标本的分子病理检测结果，其中12,386例采用ARMS-PCR检测，8,345例采用NGS检测。所有标本均为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，来自手术、穿刺活检或胸腔积液沉淀细胞，每张切片肿瘤细胞比例≥10%且数量≥100个。仅检测储存时间少于3年的FFPE组织以避免DNA降解的影响。
关键技术方法包括：ARMS-PCR采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的三种商业试剂盒（AmoyDx? EGFR 29突变检测试剂盒、AmoyDx? 肺癌10基因PCR检测试剂盒和AmoyDx? 肺癌11基因PCR检测试剂盒），所有试剂盒均覆盖EGFR S768I突变，检测限（LOD）为1%；NGS采用燃石生物（Burning Rock Biotech）的68、168或520个癌症相关基因panel，覆盖EGFR第19–21外显子，在NextSeq 500 Dx平台上进行双端测序，平均深度500×，LOD为1%。数据分析使用R（版本4.5.0），采用卡方检验、Fisher精确检验等统计方法。
三、研究结果
3.1 患者和样本的基线特征： 共检测20,731份标本，两组在年龄（平均60.30 vs. 60.93，SMD = 0.060）和性别（女性43.23% vs. 47.67%，SMD = 0.089）方面平衡良好，标准化均数差（SMD）均低于0.1，表明两组间具有充分的均衡性。
3.2 ARMS-PCR与NGS检测EGFR S768变异体的比较： ARMS-PCR检测EGFR S768变异体的检出率为0.40%（50/12,386），检出的S768位点变异均为S768I。NGS的检出率为1.15%（96/8345），显著高于ARMS-PCR（p < 0.001；RD = ?0.007，95% CI：?0.010至?0.005；RR = 0.351，95% CI：0.250–0.493）。NGS还识别出S768_D770dup（占32/96，33.33%）、S768_V769insLDS（占1/96，1.04%）和S768_V769delinsIL（占2/96，2.08%）等其他变异类型。仅比较S768I错义突变时，ARMS-PCR检出率（0.40%）仍显著低于NGS（0.73%，61/8345）（p = 0.002）。
3.3 EGFR S768I变异与其他EGFR突变共存分析： ARMS-PCR检出的50例S768I中，35例（70.00%）同时携带其他EGFR突变，包括G719A/C/S（48.00%）、L858R（18.00%）和ex19_del（6.00%）。NGS检出的61例S768I中，58例（95.08%）同时携带其他EGFR突变。在两种方法共同覆盖的变异范围内，NGS检出的共存率（93.75%，45/48）仍显著高于ARMS-PCR（70.00%）（p = 0.002）。NGS还检出S768I与EGFR拷贝数扩增共存（14.75%，9/61）。有趣的是，S768位点插入突变很少与其他EGFR突变共存，仅1例（3.03%），显著低于S768I错义突变与其他EGFR突变的共存率（95.08%）（p < 0.001）。患者水平敏感性分析和性别分层分析结果与主要标本水平分析一致。
3.4 ARMS-PCR与NGS结果不一致的病例： 在ARMS-PCR检测S768I阳性的50份标本中，3份经NGS鉴定为V769_D770insSVV（c.2307_2308insAGCGTGGTG）、S768_V769delinsIL（c.2303_2305delinsTCT）和S768_V769delinsIL（c.2303_2305delinsTTT）。另有1份标本ARMS-PCR检测EGFR阴性，但NGS鉴定为S768_V769insLDS（c.2304_2305insCTGGACAGC），该变异不在ARMS-PCR检测范围内。通过比较引物和突变序列，研究人员发现每种突变与引物之间仅有一个错配，提示S768位点周围的复杂突变或插入可能由于引物非特异性结合而导致ARMS-PCR结果不一致。
3.5 结果不一致病例的临床病理特征和治疗： 4例结果不一致的患者平均年龄53.8±9.2岁，3例女性，1例男性，均为肺腺癌，3例为晚期（IV期），1例为早期（IA3期）。患者1因ARMS-PCR检出S768I接受埃克替尼联合放疗，5个月后出现肾上腺转移进展，换用阿法替尼2.6个月后再次进展，NGS复查确认为V769_D770insSVV，调整方案为培美曲塞加卡铂联合依沃西单抗（PD-1/VEGF双特异性抗体），随访近6个月无进展。患者2和患者3经NGS确认为S768_V769delinsIL，患者2因2022年无靶向ex20ins药物获批，继续阿法替尼治疗但疗效不佳，多次换药后失访；患者3因早期疾病手术切除后未接受靶向治疗。患者4 ARMS-PCR阴性但NGS检出S768_V769insLDS，初始接受培美曲塞加卡铂联合信迪利单抗（PD-1抑制剂）治疗，因不耐受换用sunvozertinib（靶向EGFR ex20ins），随访16.3个月病情稳定。
四、讨论总结与研究结论
ARMS-PCR具有检测周期短、成本低的优势，在分子病理诊断中广泛应用。但由于覆盖位点有限，ARMS-PCR无法检测所有EGFR突变类型，这在一定程度上解释了其对EGFR S768位点变异检出率低于NGS的原因。EGFR ex20ins变异通常与经典EGFR突变互斥，而大多数EGFR S768I变异常与G719X或L858R突变共存。ARMS-PCR检出的S768I与其他EGFR突变共存率显著低于NGS，可能原因包括NGS能识别超出ARMS-PCR覆盖范围的共存突变，以及部分ARMS-PCR检出的S768I实际为EGFR外显子20插入或复杂突变。鉴于S768I变异与其他EGFR突变共存的高频率，当ARMS-PCR仅检出EGFR S768I时，特别是接受阿法替尼等S768I靶向TKI治疗后短期内出现疾病进展的NSCLC患者，建议采用NGS进行验证。
研究人员通过序列比较发现，S768_V769delinsIL与S768I在2303位点均存在G>T替换，V769_D770insSVV的引物序列片段与EGFR S768I引物高度匹配且仅有一个错配，其余引物序列表现出强结合稳定性，可能导致错误延伸。这提示ARMS-PCR平台对S768位点周围某些复杂突变或插入可能存在引物非特异性结合的限制，但该假设仍需进一步实验验证。
本研究存在以下局限性：回顾性单中心设计，详细临床病理信息不完全统一；非配对设计可能引入选择偏倚；研究时间跨度长（2011–2025年），试剂盒和检测流程虽有更新但无法完全排除潜在影响因素；研究主要聚焦于EGFR S768位点，其他位点的类似问题需进一步验证。
研究结论：ARMS-PCR和NGS在检测EGFR S768I方面均表现优异，但对于EGFR S768位点周围的复杂突变或插入，ARMS-PCR可能因引物非特异性结合而产生不准确结果。对于ARMS-PCR仅检出EGFR S768I且无其他EGFR突变、并在接受阿法替尼等EGFR S768I导向靶向治疗期间出现快速疾病进展的患者，可考虑采用NGS确认突变以指导适当的靶向治疗。
