效应器驱动的SIR2介导丝状组装激活NLR样蛋白Avs5以介导细菌抗病毒防御

《Cell Reports》：SIR2-mediated filament assembly activates the NLR-like protein Avs5 for bacterial antiviral defense

　　

与哺乳动物核苷酸结合和寡聚化结构域受体（NLRs）类似，细菌NLR样蛋白介导抗病毒防御。Avs5是短细菌NLR样蛋白大家族的一个代表，包含N端SIR2效应结构域、中央核苷酸结合结构域（NBD）和C端传感器结构域。经典炎症小体NLRs利用NBD寡聚化来成核效应结构域丝状体，而Avs5形成SIR2介导的丝状体，将受体组装与NADase（NAD⁺水解酶）激活偶联。在静息状态下，ATP结合的Avs5为单体，随后形成SIR2介导的二聚体，该二聚体可能代表阶梯式激活途径中的中间体。激活后，NBD的ATP依赖性构象重塑促进这些二聚体转化为活性丝状体。结构指导的突变、生化实验和功能分析表明，丝状组装是高效NAD⁺水解和抗噬菌体防御所必需的。这些发现揭示了一种效应器驱动的激活机制，并拓展了NLR蛋白在生命各域中将高阶组装与免疫防御偶联的原理。

研究背景方面，NLRs（nucleotide-binding and oligomerization domain receptors，核苷酸结合和寡聚化结构域受体）是动物和植物细胞内免疫的核心组分。许多NLRs激活后形成高阶信号组装，如动物炎症小体和植物抗病小体；经典NLRs通常含中央NACHT或NB-ARC、C端LRR及可变N端效应结构域，并通过NBD（nucleotide-binding domain，核苷酸结合结构域）寡聚组织N端效应模块。细菌NLR样蛋白参与抗噬菌体防御，含保守NACHT及多样N端和C端结构域；Avs3和Avs4通过NACHT介导四聚化并激活核酸酶。Avs5代表短NLR样蛋白家族，具N端SIR2效应器、中央NACHT和较短的C端TPR（tetratricopeptide repeat，四肽重复）区域。其如何组装、NACHT与SIR2如何协同以及是否遵循NACHT中心寡聚机制尚不清楚，因此研究人员开展结构、生化与功能研究。研究表明，Avs5经ATP结合自抑制单体、SIR2介导二聚体中间体、NACHT构象开放和SIR2核心丝状体组装，激活NAD⁺水解并执行抗噬菌体防御，揭示效应器驱动的阶梯式激活机制，拓展了NLR蛋白高阶组装与免疫防御偶联的结构原则。

关键技术方法方面，研究人员以E. coli Avs5重组蛋白（序列来源于Addgene质粒157899）、E. coli MG1655和T4噬菌体（ATCC 11303-B4）为对象，采用质量光度法分析浓度依赖寡聚，cryo-EM（cryo-electron microscopy，冷冻电镜）解析单体、二聚体和丝状体结构，负染EM观察丝状体，结构指导定点突变，尺寸排阻色谱分析ATP/ADP条件下的组装，测定ATPase（ATP水解酶）和以ε-NAD⁺为底物的NADase活性，并进行噬菌体plaque（噬菌斑）实验。

研究结果如下。Avs5单体结构：质量光度法显示20 nM时以单体为主，30或40 nM出现少量二聚体和五聚体，100 nM呈单体至五聚体宽分布；cryo-EM解析3.5 ?单体为L形，SIR2含大、小结构域，NACHT含NBD、HD1（helical domain 1，螺旋结构域1）、WHD（winged-helix domain，翼状螺旋结构域）和HD2，呈闭合自抑制构象，NBD口袋结合ATP，K353、R349、D397和S398等关键；TPR约150残基并形成小腔。结论是静息Avs5主要为ATP结合单体。Avs5形成SIR2介导的二聚体中间体：高浓度cryo-EM获得3.76 ?二聚体I和4.06 ?二聚体II，界面由两个SIR2头尾排列形成，原体保持闭合，二聚体II一亚基NACHT/TPR较动态；结论为该二聚体是阶梯激活中间体，SIR2二聚化本身不诱导NACHT大开放。SIR2介导的Avs5丝状体组装：浓度≥60 nM及37°C促进丝状体，cryo-EM 3.79 ?显示右手螺旋，每亚基旋转142.3°、轴向上升39.8 ?，直径约200 ?；SIR2位于核心，形成type I和type II界面，并伴SIR2-NBD及WHD-WHD接触，NBD间不直接互作，TPR外伸；结论是效应器中心聚合。结构重塑伴随Avs5丝状体形成：从单体/二聚体到丝状体，NACHT-TPR相对SIR2旋转约90°，WHD-HD2相对NBD-HD1绕HD1-WHD铰链旋转约90°；丝状体结合ADP，ATPase活性浓度依赖，K353E和S398A降低活性，界面突变亦降低ATP水解，ATP促进组装而ADP不足；结论是ATP结合建立组装 competent 状态，水解偶联构象重塑和丝状体稳定。丝状体形成对NAD⁺耗竭和抗噬菌体防御至关重要：界面突变破坏丝状体，NADase活性浓度依赖且低于30 nM几乎检测不到，N128A及界面突变丧失NADase活性；单体中活性位点loop（211–221）遮蔽NAD⁺结合位点，丝状体形成后重排开放；T4噬菌斑实验显示野生型Avs5赋予强抗性，丝状缺陷、ATPase位点和NADase位点突变体均丧失抗噬菌体防御。结论是丝状组装许可NADase激活并支撑抗噬菌体防御。

讨论部分，研究人员提出Avs5阶梯激活模型：ATP结合自抑制单体经SIR2介导二聚体中间体，在尚未鉴定的配体触发下NACHT开放，开放二聚体聚合为SIR2核心丝状体，进而解除SIR2活性位点自抑制、促进NAD⁺水解，NAD⁺耗竭预期导致流产感染。ATP在Avs5中的作用不同于Apaf-1等经典NLR的ADP-to-ATP交换模式：Avs5静息态结合ATP，激活时水解为ADP并偶联丝状体形成。与Wang等（Wang et al.）报道的EfAvs5比较，二者均支持丝状依赖的SIR2激活，但EcAvs5以SIR2为丝状体核心且ATP水解与组装紧密偶联，EfAvs5则保留ATP且ATPase活性较低。该研究扩展了NLR组装架构，提出受体聚合与酶激活整合于同一丝状体架构的效应器驱动机制；局限包括生理噬菌体触发未知、主要基于体外纯化蛋白、未在感染细菌细胞中直接观察丝状体。研究结论（译自原文讨论结论）：这些观察确定了一个阶梯式途径，其中NACHT结构域的开放使SIR2驱动的聚合和效应器激活成为可能；Avs5因此代表一种效应器驱动的组装机制，其中受体聚合和酶激活整合在同一丝状体架构中。