《Diagnostics》：MALDI-TOF/MS Serum Spectral Profiling for Breast Cancer Discrimination Using Direct and ACN-Assisted Workflows: A Retrospective Proof-of-Concept Study
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背景/目的：血清基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）谱图分析可能有助于乳腺癌（BrC）评估，但回顾性研究易受人口统计学和批次混杂的影响。本研究评估了直接血清法（工作流A）和乙腈（ACN）辅助法（工作流B）两种谱图分析流程。方法：工作流A
背景/目的：血清基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）谱图分析可能有助于乳腺癌（BrC）评估，但回顾性研究易受人口统计学和批次混杂的影响。本研究评估了直接血清法（工作流A）和乙腈（ACN）辅助法（工作流B）两种谱图分析流程。方法：工作流A分析了60份存档血清（30例BrC，30例对照），采用样本级嵌套10折交叉验证和L2正则化逻辑回归。工作流B包含40个样本组（20例BrC，20例阴性/比较组；每样本约四个点）；重复点在建模前进行聚合，随后进行重复的样本级五折交叉验证及批次/来源诊断分析。结果：工作流A的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.932，但两组年龄不匹配（52岁 vs. 45岁；标准化均值差约为1.03），无法排除年龄因素进行癌症特异性解读。工作流B的平均AUC为0.978 ± 0.007，平衡准确率为0.968，但阴性/比较组的批次/日期分类AUC达到0.970，跨批次迁移呈现不对称性（1.00 vs. 0.64）；其中5份比较组血清为商业来源。结论：工作流A提供了初步的组间区分证据，但仍受年龄混杂影响。工作流B在显著的批次/来源混杂背景下表现出强大的表观内部区分能力，应被视为一项分析压力测试，而非独立验证。候选m/z信号尚未鉴定；在提出癌症特异性或生物标志物相关主张之前，必须进行年龄匹配、批次平衡的外部验证及正交分子鉴定。
一、研究背景与目的
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。尽管影像学筛查与诊断手段（如乳腺X线摄影、超声和磁共振成像）仍是临床检测与管理的关键，学界仍对开发微创血液检测方法抱有浓厚兴趣，以期在分诊、风险分层或纵向监测中提供补充信息。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）能够快速从体液中产生复杂的蛋白质组学和肽组学指纹图谱，已在癌症血清谱图分析领域得到探索。然而，既往研究强调，血清肽组学对样品制备、储存、处理顺序和分析批次极为敏感，高维谱图的机器学习分类方法若缺乏严格设计，极易因人口学混杂或技术批次效应而产生虚假的高区分性能。为此，本研究旨在评估两种简化的血清MALDI-TOF/MS谱图分析流程——直接血清蛋白/肽分析（工作流A）和乙腈（ACN）辅助沉淀分析（工作流B）——在乳腺癌（BrC）鉴别中的表现，并重点审视混杂因素对结果解读的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员采用了两种独立的血清MALDI-TOF/MS谱图分析工作流。工作流A为直接血清蛋白/肽分析，样本来自Asan Medical Center的回顾性临床队列，随机选取60份血清（30例BrC，30例对照）。工作流B为ACN辅助的探索性实验，包含40个样本组（20例BrC，15例临床非乳腺疾病血清及5例商业来源Lampire血清作为阴性/比较组）。两种工作流均使用IDSys LT? MALDI-TOF质谱仪采集谱图。数据分析中，工作流A采用样本级嵌套分层10折交叉验证，训练集内进行单因素方差分析（ANOVA）结合Benjamini-Hochberg假发现率校正的特征选择，并使用L2正则化逻辑回归模型进行分类。工作流B采用样本级重复五折交叉验证（10次重复），同样限制特征选择于训练折内，并对技术重复点按样本级取均值聚合后再建模，同时进行了批次/来源诊断分析，包括PCA可视化、批次分类器以及跨批次迁移测试。
三、研究结果
3.1 工作流A：直接血清谱图分析
该分析纳入30例BrC和30例对照血清，所有参与者均为女性。BrC组平均年龄52岁（标准差7.7），对照组平均年龄45岁（标准差5.8），两组年龄差异显著，标准化均值差约为1.03，表明存在严重的人口学不平衡。通过样本级嵌套交叉验证，L2正则化逻辑回归模型获得了0.932的AUC。但由于年龄未匹配且未预设年龄校正模型，该AUC被解读为总体组间区分度，而非癌症特异性性能。
3.2 工作流B：ACN辅助实验组
该实验共产生160张谱图（每样本约4个技术重复点），经样本级聚合后形成40个分析单元。比较组材料混合了15份临床血清和5份商业血清，后者无捐赠者年龄等元数据。PCA可视化显示，按疾病标签着色时谱图呈现明显结构，但按采集批次着色时同样显示出强烈的批次相关结构，表明疾病状态与采集日期、板位和样本来源部分纠缠。
3.3 工作流B的交叉验证区分性能
在10次重复的样本级五折交叉验证中，平均AUC为0.978 ± 0.007，平均平衡准确率为0.968。这些数值代表强大的表观内部区分能力，但由于同一数据集中存在显著的日期/板位/来源结构，不能视为癌症特异性分类的证据。
3.4 候选区分性m/z区间与重复质量控制
工作流B识别出多个效应量大且在交叉验证中反复被选中的m/z区间，优先级最高的包括m/z 5155、1480和7305。这些均为5 m/z步长的区间，未经分子鉴定。大多数样本的技术重复相关性很高（中位平均相关系数0.987），但BrC样本6146为明显的技术异常值（平均重复相关系数0.192）。中位数聚合的敏感性分析仍保留了较高的区分信号。
3.5 批效应诊断
批次诊断显著改变了对工作流B高区分结果的解读。在阴性/比较组内部，区分7月3日P3板和8月12日P2板的AUC高达0.970，显示了强大的非疾病批次/日期信号。跨批次迁移呈不对称性：在一个方向上训练并测试另一方向获得AUC 1.00，反向仅为0.64；排除商业Lampire血清后反向AUC升至0.74，表明样本来源对特征空间有实质性贡献。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分明确指出，本研究不将两个工作流视为一致的生物学重复。工作流A作为主要的直接血清概念验证分析，其AUC 0.932受年龄混杂严重影响，无法确立癌症特异性。工作流B展示了在严重批次/日期/来源结构混杂下强大表观区分能力如何存在，因此被解读为分析压力测试而非独立生物学复制或验证。研究强调，统计上的交叉验证和样本级聚合无法弥补实验设计中疾病状态与批次/来源不平衡的根本缺陷。候选m/z信号仅为假设生成的谱图特征，并非经过鉴定的生物标志物。研究结论总结如下：工作流A提供了初步的概念验证证据，证明直接血清MALDI-TOF/MS谱图可以区分所研究的BrC组和对照组（交叉验证AUC 0.932），但显著的年龄不平衡意味着无法从该数据集中建立癌症特异性。工作流B在ACN辅助制备后显示出较高的表观内部区分能力，但严重的批次/日期/来源结构使其性能无法归因于恶性肿瘤。因此，工作流B被解读为探索性的分析压力测试，而非独立的生物学复制或验证。其未鉴定的m/z区间是假设生成的谱图特征，而非经过验证的生物标志物。研究未声称两个工作流检测到相同的分子种类。关键的下一步是进行独立的、年龄匹配或年龄校正的、同日同板随机化和盲法验证，配备共享的合并质控样品、完整的采集元数据、样本级重复分组和锁定的分析流程。只有在此类条件下保持可重复性的特征，才应进行后续的正交分子鉴定。
