《Pathogens》：Pan-Coronavirus Molecular Surveillance in Stool Samples from Patients with Acute Gastroenteritis: SARS-CoV-2 as the Only Coronavirus Detected
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背景：冠状病毒（CoVs）是重要的人类和动物病原体，具有呼吸道和胃肠道嗜性，并具有相当大的跨物种传播潜力。广谱分子监测方法可促进在不同临床标本中检测已知和潜在新发CoVs，从而补充病毒特异性检测。该研究旨在使用广谱泛冠状病毒（panCoV）RT-PCR方法调查
背景：冠状病毒（CoVs）是重要的人类和动物病原体，具有呼吸道和胃肠道嗜性，并具有相当大的跨物种传播潜力。广谱分子监测方法可促进在不同临床标本中检测已知和潜在新发CoVs，从而补充病毒特异性检测。该研究旨在使用广谱泛冠状病毒（panCoV）RT-PCR方法调查并分子鉴定急性胃肠炎患者粪便标本中的CoVs，并提供与未来同一健康（One Health）监测相关的基线数据。方法：分析2021年11月至2022年10月期间从急性胃肠炎患者采集的280份粪便标本。将病毒核酸进行半巢式panCoV RT-PCR，靶向正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）内RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因约600 bp的保守区域。确证扩增子通过Sanger测序和BLASTn分析进行鉴定，质量足够的序列进一步进行系统发育分析。结果：在20/280份粪便标本中检出CoV RNA（7.14%，95%精确CI，4.42–10.82%）。序列分析将全部20份阳性样本鉴定为SARS-CoV-2，16份高质量序列的系统发育分析支持种水平鉴定。在该队列中，所用检测未检出地方性非SARS-CoV-2或人畜共患CoVs。在探索性分析中，接受化疗和/或免疫抑制治疗的患者中SARS-CoV-2 RNA检出较未接受这些治疗者更频繁（18.4% vs. 5.4%；p = 0.010）。结论：对急性胃肠炎患者粪便标本进行广谱分子筛查检出SARS-CoV-2 RNA，而该队列中应用检测未检出地方性非SARS-CoV-2或人畜共患CoVs。这些发现提供了未充分探索临床标本类型中冠状病毒RNA检出的基线数据，并支持基于粪便的分子监测在未来综合同一健康监测策略中的潜在补充作用。仅检出病毒RNA不能证明病毒感染性或粪口传播。
研究背景：冠状病毒（CoVs）可感染人类及多种脊椎动物，具有基因组可塑性、重组和跨物种传播能力；正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）包括α、β、γ、δ四个属，已知7种人冠状病毒（HCoVs），其中HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HCoV-HKU1多引起轻症上呼吸道感染，而SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的出现显示CoVs跨种屏障能力。已有研究用分子方法在急性胃肠炎患者粪便中检出所有人CoVs，但其胃肠道致病贡献尚不确定；SARS-CoV-2具有胃肠道受累和粪便RNA排出的证据，系统综述和荟萃分析报告确诊COVID-19患者粪便SARS-CoV-2 RNA检出率约40–52%，且粪便RNA可能在呼吸道标本转阴后仍可检出。Fumian et al.在急性胃肠炎患者36份粪便中检出10份（27.5%）SARS-CoV-2 RNA。动物CoVs如犬冠状病毒（CCoV）、牛冠状病毒（BCoV）及重组犬–猫冠状病毒（CCoV-HuPn-2018）提示人畜共患和重组风险，故需能识别已知和潜在新发CoVs的监测。常规检测多针对已明确CoVs，广谱panCoV RT-PCR靶向RdRp保守区可补充检测遗传多样或非预期CoVs；但人粪便作为广谱CoV监测标本仍相对未充分探索，且粪便基质对分子检测具有挑战。该研究因此对急性胃肠炎患者粪便进行panCoV RT-PCR筛查、测序和系统发育分析，以确定可检出CoV谱并提供未来整合监测（包括One Health框架）的基线数据。
研究人员开展了一项前瞻性单中心研究，纳入2021年11月26日至2022年10月1日在Mersin University Faculty of Medicine Hospital、Department of Medical Microbiology、Bacteriology and Parasitology Laboratory就诊的连续急性胃肠炎患者280份水样便标本；纳入急性胃肠道症状且提供水样便者，每例仅一份标本，均未接受抗病毒治疗且腺病毒/轮状病毒快速抗原检测阴性。研究采用已发表的半巢式panCoV RT-PCR检测正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）RdRp基因保守区，采用两种独立扩增工作流，对可重复阳性扩增子进行Sanger测序、BLASTn分析和系统发育分析，并以SPSS进行统计比较。结果显示，20/280份标本（7.14%，95%精确置信区间[CI] 4.42–10.82%）检出CoV RNA，全部20份经序列分析鉴定为SARS-CoV-2，16份高质量双向序列的系统发育分析支持种水平鉴定；所用检测未检出地方性非SARS-CoV-2或人畜共患CoVs。探索性分析中，接受化疗和/或免疫抑制治疗者SARS-CoV-2粪便RNA阳性率高于未接受者（18.4% vs. 5.4%；粗比值比[OR] 3.98，95% CI 1.47–10.73；Fisher精确检验p = 0.010）。该研究提供了未充分探索临床标本类型中冠状病毒RNA检出的基线分子监测数据，说明粪便广谱冠状病毒筛查可在不限定单一靶标的情况下检出循环CoV RNA，并支持基于粪便的分子监测在未来综合One Health监测策略中的潜在补充作用；但粪便RNA检出本身不能证明感染性病毒存在、粪口传播或急性胃肠炎因果作用。
关键技术方法（不超过250字）：研究为前瞻性单中心研究，样本队列来源为Mersin University Faculty of Medicine Hospital医学微生物学系细菌学与寄生虫学实验室2021年11月26日至2022年10月1日连续急性胃肠炎患者水样便280份。方法包括：半巢式panCoV RT-PCR靶向正冠状病毒亚科RdRp基因约600 bp保守区；两种工作流（一步法RT-PCR后行半巢式PCR；cDNA合成后行第一轮PCR及半巢式PCR）；可重复阳性扩增子行Sanger测序、BLASTn鉴定；MEGA 11以Neighbor-Joining构建系统发育树，1000次bootstrap；SPSS进行卡方/Fisher精确检验，并以Clopper–Pearson法计算95%精确CI。原文说明该panCoV RT-PCR未针对粪便基质额外分析验证，未设内部提取对照、专用抑制实验或实验性检测限分析。
3.1 患者（Patients）：280例患者中女性126例（45.0%）、男性154例（55.0%），中位年龄18岁（四分位距[IQR] 6–60；范围1–96岁）；102例（36.4%）住院（病房或重症监护室），178例（63.6%）门诊；粪便白细胞检出18/280（6.4%），其余262/280（93.6%）未检出。该部分通过临床资料和常规粪便显微镜检查描述研究人群特征。
3.2 泛冠状病毒RT-PCR结果及两种扩增工作流比较（PanCoV RT-PCR Results and Comparison of the Two Amplification Workflows）：全部280份标本均以一步法RT-PCR/半巢式PCR工作流和基于cDNA的PCR/半巢式PCR工作流独立检测；20份标本至少在一种工作流中产生可重复的预期大小扩增子，其中10份仅在一步法工作流反应，另10份仅在cDNA工作流反应，无标本在两种工作流均反应，260份在两种工作流均无反应。所有初筛反应标本均以相应工作流重测，仅可重复扩增子进入Sanger测序。该部分通过双工作流平行检测和重复验证确定可重复panCoV RT-PCR反应性。
3.3 序列分析结果（Sequence Analysis Results）：全部20份（7.1%，20/280，95%精确CI 4.42–10.82%）可重复反应扩增子均获得可解释序列，并经BLASTn分析鉴定为SARS-CoV-2；16份获得高质量双向序列，4份标本（样本2、66、219和250）仅依据高质量正向读段进行种鉴定。该部分通过Sanger测序和BLASTn比对完成病毒种水平鉴定。
3.4 系统发育分析（Phylogenetic Analysis）：对16份具有高质量双向序列数据的标本进行系统发育分析，结果支持BLASTn所得种水平鉴定；研究序列与GenBank参考SARS-CoV-2序列聚集，并与分析纳入的地方性人类和动物CoV参考序列区分。16份临床标本的部分RdRp核苷酸序列提交GenBank，登录号为PX926484–PX926499。原文说明该树用于支持种水平鉴定，不用于SARS-CoV-2谱系或亚谱系划分。该部分通过Neighbor-Joining系统发育树验证序列归属。
3.5 临床发现与RT-PCR阳性（Clinical Findings and RT-PCR Positivity）：SARS-CoV-2粪便阳性与患者住院/门诊设置、粪便白细胞、胃肠道症状、其他临床症状、当前或既往COVID-19状态以及所评估的基础疾病类别均无统计学显著关联（均p > 0.05）；存在至少一种基础疾病与SARS-CoV-2阳性亦无关联（p = 0.388）。探索性分析显示，接受化疗和/或免疫抑制治疗者SARS-CoV-2阳性率高于未接受者（18.4% vs. 5.4%），粗OR为3.98（95% CI 1.47–10.73；Fisher精确检验p = 0.010）。20例粪便SARS-CoV-2阳性患者中女性10例（50.0%）、男性10例（50.0%），中位年龄34岁（IQR 7.3–58.8；范围1–72岁）；住院8例（40.0%）、门诊12例（60.0%）；粪便白细胞检出2/20（10.0%）。粪便采样时，280例中4例有记录的当前COVID-19阳性，但均无SARS-CoV-2阳性粪便标本；27例有既往COVID-19史，其中1例粪便检出SARS-CoV-2 RNA。该部分通过临床资料与RT-PCR结果的探索性统计比较得出上述关联性结论。
讨论部分总结：该研究将广谱panCoV RT-PCR应用于急性胃肠炎患者粪便，检出20/280份（7.1%）CoV RNA且全部为SARS-CoV-2，未检出地方性非SARS-CoV-2或人畜共患CoVs。原文指出，Xiu et al.描述的靶向Orthocoronavirinae RdRp保守区的panCoV引物集此前尚未在急性胃肠炎患者粪便中广泛评价；既往比较研究显示该引物集在人类、动物和环境标本中对四个CoV属具有广谱反应性。Mira et al.在蝙蝠中使用靶向RdRp的pan-CoV方法检出α和βCoVs，而Mombo et al.用巢式PCR筛查229份野生灵长类粪便未检出CoVs；原文强调阴性发现也可提供基线监测信息，本研究未检出其他人CoVs应解释为特定人群和采样期的监测信息，而非一般人群不存在这些病毒。粪便基质中的胆汁盐、血红蛋白、复杂多糖等可能抑制逆转录和PCR，对使用简并引物的广谱检测尤其相关。SARS-CoV-2可累及胃肠道，COVID-19患者可有腹泻、恶心、呕吐和腹痛；多数粪便研究使用病毒特异性RT-qPCR，报告粪便RNA检出率约27%–53%，Fumian et al.在急性胃肠炎患者中报告10/36（27.5%）。本研究7.1%较低，原文归因于研究人群、采样期、检测设计和病例确认差异；因无配对呼吸道检测和定量病毒载量数据，且未平行进行靶向N基因的SARS-CoV-2特异性RT-qPCR，不能排除低浓度SARS-CoV-2 RNA未被广谱检测检出。粪便SARS-CoV-2 RNA可在呼吸道感染后持续检出，故粪便RNA阳性不一定表示急性胃肠道感染；本研究无纵向随访、配对呼吸道标本、病毒载量定量、病毒培养或组织分析，不能区分急性粪便RNA排出与延长RNA持续，也不能评估胃肠道复制，不应解释为持续感染或急性COVID-19后表现。20例粪便阳性者均无记录当前COVID-19阳性，仅1例有既往COVID-19史，但原文指出不能排除未识别或无症状既往感染。探索性发现化疗和/或免疫抑制治疗者SARS-CoV-2 RNA检出更频繁，与既往免疫受损者延长SARS-CoV-2 RNA排出的报告一致；因仅20例阳性且无纵向或定量病毒数据，该关联应谨慎解释并需更大队列确认。原文强调，仅检出病毒RNA不能确定存在复制 competent virus 或粪口传播，也不能确定SARS-CoV-2是急性胃肠炎病因；患者未系统评估其他病毒、细菌或寄生虫肠道病原体，故不能确定其他病原体贡献，且粪便SARS-CoV-2阳性与粪便白细胞或胃肠道症状无显著关联。方法学上，两种扩增工作流完全不一致：10份仅一步法反应、10份仅cDNA法反应，所有反应扩增子重测可重复并经Sanger测序鉴定为SARS-CoV-2；不一致可能反映逆转录效率、模板利用、粪便PCR抑制或低病毒RNA浓度下随机扩增差异，因无独立定量 assay、内部提取对照或抑制 assay，无法确定各因素相对贡献，故7.1%应解释为至少一种工作流可重复且序列确认的SARS-CoV-2检出比例，而非验证的患病率估计或任一工作流诊断灵敏度；单一工作流阴性不应解释为标本无冠状病毒RNA。局限性包括无配对呼吸道样本、未做病毒载量定量和病毒培养、panCoV RT-PCR未针对粪便基质分析验证且无内部提取对照/专用抑制检测/实验检测限、无平行SARS-CoV-2特异性RT-qPCR、575 bp RdRp片段较短且保守导致部分内部分支bootstrap支持低、单中心且阳性样本少、未系统评估其他急性胃肠炎病原体、探索性统计分析因阳性例数少需谨慎；无与采样期匹配的Mersin废水定量SARS-CoV-2数据，无法评估粪便阳性与社区废水病毒载量相关性。原文认为，未来将临床标本广谱检测与时间和地理匹配的废水测序结合，可更全面观察CoV循环；尽管有局限，本研究说明对非常规CoV监测临床标本类型应用广谱冠状病毒筛查的补充价值，SARS-CoV-2为所用检测唯一检出CoV应限定于该患者人群和采样期，不意味着其他CoVs真实不存在；持续整合人类临床、动物和环境采样有助于检测非预期或新发CoVs并监测人–动物–环境界面的冠状病毒循环变化。
研究结论翻译：总之，对急性胃肠炎患者粪便标本进行广谱panCoV RT-PCR筛查，在该队列中检出SARS-CoV-2 RNA，但所用检测未检出地方性非SARS-CoV-2或人畜共患CoVs。这些发现提供了来自未充分探索临床标本类型的基线分子监测数据，并说明基于粪便的广谱冠状病毒筛查的潜在补充价值。粪便中检出SARS-CoV-2 RNA不能确定存在感染性病毒、粪口传播或在急性胃肠炎中的因果作用，也不能区分急性感染与延长RNA持续。接受化疗和/或免疫抑制治疗患者中SARS-CoV-2 RNA检出频率较高应视为探索性，需在更大队列中确认。整合人类临床、动物和环境采样（包括基于废水的监测）的持续监测，可能在同一健康（One Health）框架内加强对意外或新发冠状病毒的准备。
