基于自动化图像处理算法的多线侧向层析生物传感器定量识别与评估

《Journal of Analysis and Testing》：Multi-Line Recognition and Quantitative Assessment of Strip-Type Biosensors Using an Automated Image Processing Algorithm

　　

侧向层析检测（LFA）是一种广泛应用于即时检测（POC）的诊断技术，因其便携性、操作简便和结果快速而备受重视。然而，传统目视判读方式限制了定量分析的实现，并可能导致主观判读和假性结果。本研究提出了一种基于Python的新型自动化图像处理算法，用于可同时检测多种分析物的多线LFA的定性与定量分析。研究开发了两种多重检测格式：针对病原体的四重LFA（检测大肠杆菌（EC）、肺炎链球菌（SP）、流感嗜血杆菌（HI）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2））和针对微小RNA（miR-21、miR-let-7a和miR-155）的三重LFA。该算法通过五个阶段处理采集图像——试纸条外壳检测、感兴趣区域提取、条带分割、边界检测和密度定量——同时实现定性分类和定量分析物浓度测定。性能评估显示，该算法具有高特异性、无交叉反应，且与基于ImageJ的分析相比具有优异的定量准确性。两种多线LFA的分类指标均表现出优异的灵敏度、特异性和总体准确率。该集成方法克服了传统LFA判读的局限性，提供了低成本、便携且可扩展的多分析物诊断方案，适用于医疗保健、食品和环境监测以及资源有限环境中的POC应用。该平台还可实现与人工智能（AI）驱动分析和基于云端的远程健康监测的未来集成，支持快速、去中心化的诊断能力。

论文解读：基于自动化图像处理算法的多线侧向层析生物传感器定量识别与评估

一、研究背景与意义

侧向层析检测（Lateral Flow Assay, LFA）作为一种广泛应用的即时检测（Point-of-Care, POC）诊断技术，凭借其便携性、操作简便和结果快速等优势，在医疗保健、环境监测和食品真实性检测等多个领域发挥着重要作用。然而，传统LFA依赖目视判读结果，这一方式不仅限制了定量分析的实现，还容易导致主观判读偏差和假性结果的出现。随着体外诊断需求的日益增长，开发能够提供准确、可靠结果的现代化分析方法成为研究热点。

当前，尽管已有多种自动化图像处理策略被开发用于LFA结果的自动分析与定量，但这些方法主要局限于单条检测线的LFA，即每次仅能检测单一分析物。在多重检测领域，仅有少数研究实现了双分析物的同时检测，而针对三条及以上检测线的多重LFA自动化定量分析仍属空白。此外，多数现有研究仅报告检测的准确率、灵敏度和特异性，提供定量结果的寥寥无几。因此，开发能够同时检测多种分析物并进行自动化定量分析的多线LFA系统，对于提升诊断效率和准确性具有重要的科学意义和应用价值。

二、研究内容与主要结论

针对上述技术瓶颈，研究人员开发了一种基于Python的新型自动化图像处理算法，用于多线LFA的定性与定量分析。研究构建了两种多重检测格式：针对病原体的四重LFA（检测大肠杆菌（Escherichia coli, EC）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, SP）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae, HI）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2））和针对微小RNA（miR-21、miR-let-7a和miR-155）的三重LFA。该算法通过五个处理阶段——试纸条外壳检测、感兴趣区域提取、条带分割、边界检测和密度定量——实现自动化分析。性能评估表明，该算法具有高特异性、无交叉反应，且定量准确性优于基于ImageJ的传统分析方法。分类指标显示，四重LFA的准确率、灵敏度和特异性分别为95.2%、100%和89.2%，三重LFA分别为92.3%、88.4%和96.7%，总体准确率、灵敏度和特异性分别达到94.3%、96.5%和91.6%。该集成系统克服了传统LFA判读的局限性，为多分析物POC诊断提供了低成本、便携且可扩展的技术方案。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：金纳米颗粒-抗生物素抗体偶联物（AuNPs-Anti-Biotin）的合成与信号放大系统；多重LFA试纸条的构建与优化，包括检测探针的固定量、控制区生物素化牛血清白蛋白（b-BSA）用量及运行缓冲液组分的系统优化；基于Python的图像处理算法开发，涵盖图像灰度化转换、试纸条外壳检测与提取、条带区域分割、垂直边界检测和密度定量五个核心阶段；以及使用3D打印技术设计制造专用试纸条外壳，确保图像采集的一致性和可重复性。此外，研究采用智能手机进行图像采集，验证了系统在不同设备和光照条件下的适用性。

四、研究结果

4.1 多线LFA的构建与优化研究

研究人员首先对多线LFA的构建条件进行了系统优化。通过测试不同量的DNA检测探针（2.5至30 pmol），确定了各靶标的最佳固定量：肺炎链球菌为2.5 pmol，大肠杆菌、流感嗜血杆菌和SARS-CoV-2为5 pmol；对于微小RNA，miR-let-7a为5 pmol，miR-21和miR-155为10 pmol。控制线的构建优化确定7.5 ng b-BSA为最佳用量。此外，通过对比不同颜色组合的试纸条外壳和背景，确定黑色外壳配白色背景提供了最高的对比度，有利于算法对外壳的准确识别。

4.2 交叉反应研究

为验证所构建多线LFA的特异性，研究人员将每种靶标（100 fmol）分别与多重试纸条进行分析。结果显示，仅有与样本中靶标对应的检测线显色，未观察到交叉反应。值得注意的是，SARS-CoV-2 PCR产物的分析最初在其他检测线上出现了微弱交叉反应，通过将运行缓冲液中十二烷基硫酸钠（SDS）浓度从0.5%提高至0.65%（w/V）后成功解决，这是因为SDS作为一种强效阴离子去污剂，能够通过破坏弱疏水分子相互作用来减少非特异性结合。

4.3 图像处理算法的开发

研究人员详细描述了所开发算法的五个处理阶段。第一阶段将输入的RGB彩色图像转换为灰度图像（强度通道）。第二阶段通过阈值二值化、形态学滤波（3×3核膨胀和9×9核闭运算）、连通域分析（CCA）和凸包检测等步骤，识别并提取包含试纸条的外壳区域，并根据参考点自动校正图像方向和旋转角度。第三阶段通过计算垂直轴和水平轴上的像素和，精确定位包含检测线的内部区域边界。第四阶段将区域划分为多个重叠截面，通过识别局部极大值和极小值来精确定位各检测线的垂直边界，并扣除背景以提高密度计算的准确性。第五阶段计算每条检测线的平均强度值，并通过训练得到的校准函数将其转换为对应的目标浓度值。

4.4 校准曲线的构建与系统训练

研究人员使用已知浓度的标准样本完成完整检测流程，为每个靶标构建了独立的校准曲线。各靶标检测线的密度与靶标量之间呈现良好的线性关系，其中SARS-CoV-2的校准曲线在对数尺度上呈线性。与ImageJ软件手动分析结果相比，自动化图像处理算法表现出更优的性能。此外，通过比较单重和多重试纸条对miR-21的检测，证实多重检测并未降低检测灵敏度。

4.5 系列样本分析与系统验证

研究人员分析了含有不同靶标混合物的系列样本，定量分析结果显示各靶标的回收率范围：大肠杆菌为47.1%–144.0%，流感嗜血杆菌为53.5%–148.3%，肺炎链球菌为53.3%–142.9%，SARS-CoV-2为58.5%–100.9%；微小RNA方面，miR-155为53.3%–140.0%，let-7a为50%–147.7%，miR-21为53.4%–147.2%。与传统方法相比，该算法的定量准确性优于ImageJ软件分析（各靶标回收率范围分别为35.9%–148.0%、32.6%–140.0%、61.1%–133.3%和61.5%–125.0%），并与商用侧向层析读条仪（ESEQuant Flex Fluo）的结果相当（后者回收率范围分别为46.0%–159.8%、53.2%–157.2%、40.4%–162.0%和75.0%–150.0%）。重要的是，该算法实现了检测线的全自动定位，而商用读条仪通常需要手动识别各检测区域。基于混淆矩阵的分类评估显示，四重LFA的准确率、灵敏度和特异性分别为95.2%、100%和89.2%，三重LFA分别为92.3%、88.4%和96.7%，总体性能指标分别为94.3%、96.5%和91.6%。

五、讨论与结论

本研究成功开发并验证了一种新型、低成本的基于Python的自动化图像处理算法，用于多分析物LFA的定性与定量分析。该系统的创新之处在于能够同时分析多达四条检测线，远超现有系统最多两条检测线的能力。研究通过优化检测探针固定量、金纳米颗粒-抗体偶联物、运行缓冲液和3D打印试纸条外壳等关键组件，确保了系统的稳健性能。使用两种不同智能手机在不同光照条件下采集图像的验证结果表明，系统性能不受设备类型和背景光照的影响。图像可在任意方向或距离下采集，因为试纸条外壳的特殊设计使算法能够准确定位和对齐。该系统的唯一限制是需要试纸条外壳与背景之间存在显著对比度（如黑白搭配）以实现准确识别。

与传统分析工具相比，该算法在多重检测的复杂场景下表现出更优的定量准确性和自动化程度。该研究通过将多分析物检测与低成本、自动化、便携式图像分析相结合，推动了纸基诊断技术的前沿发展，为资源有限环境下的医疗保健、食品真实性控制和环境监测提供了可扩展的部署方案。未来该平台有望与人工智能（AI）驱动的分类系统和基于云端的实时远程健康监测相集成。研究人员的最终目标是开发用户友好的专用智能手机应用程序，可与任何多重快速检测相结合，包括SARS-CoV-2、流感和呼吸道合胞病毒（RSV）的多重快速检测，使任何用户都能在实验室、现场检测和自检场景中便捷使用，满足即时检测的需求。