探索性单细胞多组学提示难治性类风湿关节炎中初始CD4+ T细胞失调

《iScience》：Exploratory single-cell multiomics suggests naive CD4+ T cell dysregulation in treatment refractory rheumatoid arthritis

　　

约20%的类风湿关节炎（RA）患者对多种靶向治疗仍难治，构成重要临床挑战。研究人员对14,625个原代CD4⁺ T细胞进行单核转录与染色质景观分析（10x Genomics Epi Multiome），这些细胞分离自未接受治疗的早期RA和难治性RA（按EULAR难治性定义）患者。研究人员系统分析循环调控谱，以揭示可能促成难治表型的潜在机制和治疗靶点。研究人员强调初始和Th1样记忆CD4⁺ T细胞中疾病阶段特异性改变。尤其难治性初始细胞显示活化增强特征、与T细胞无反应性（anergy）一致的信号通路上调、调控位点（如FOXP1、ICOS）调控减弱及刺激反应钝化；与更去敏化或耗竭状态一致。LGALS3、ZBTB7B和FOXO4等基因成为难治状态的潜在候选调控因子。最后，通过RA全基因组关联研究（GWAS）整合，研究人员优先识别顺式调控元件中的推定因果变异。

类风湿关节炎（RA）是一种常见慢性炎症性疾病，发病率约0.5%–1%，以关节炎症、疼痛、肿胀和残疾为特征。改善病情抗风湿药（DMARDs）及生物/靶向合成DMARDs改善了临床结局，但治疗常为试错模式，患者可能轮换多种药物。约20%患者即使接受不同作用机制治疗仍无效，欧洲抗风湿病联盟（EULAR）将其定义为难治性（D2T）RA，文中称难治性RA（rRA）。遗传学研究提示T细胞失调是RA病因之一，GWAS定位100余个易感位点，多数位于CD4⁺ T细胞增强子/启动子区域；表达数量性状位点（eQTL）和Capture Hi-C显示T细胞中细胞/状态特异性调控，但rRA生物学机制研究较少，现有调控图谱多基于健康或bulk细胞，尚未解析疾病阶段和细胞状态特异调控。因此，研究人员提出rRA由CD4⁺ T细胞失调 underpins，并开展单细胞多组学比较未治疗早期RA（eRA）与rRA。研究人员对14,625个原代CD4⁺ T细胞进行单核转录组和染色质景观分析，比较疾病连续谱两端，识别细胞群、调控景观、转录因子（TF）活性、刺激反应及GWAS整合。结论提示rRA初始CD4⁺ T细胞存在活化增强、无反应性通路上调、FOXP1/ICOS调控减弱和刺激反应钝化，LGALS3、ZBTB7B、FOXO4等为候选调控因子；重要意义在于提供rRA潜在机制和治疗靶点，并优先识别顺式调控元件（CRE）中的推定因果变异。

研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法如下：样本来自PRECISE-RA观察性队列，纳入3例未治疗eRA（≤12个月症状）和3例rRA（EULAR D2T定义：至少2种不同机制生物/靶向合成DMARD无效且有活动性疾病），均血清阳性且28关节疾病活动评分-红细胞沉降率（DAS28-ESR）>3.2；外周血CD4⁺ T细胞经未刺激或αCD3/CD28刺激4 h；采用10x Genomics Epi Multiome ATAC+基因表达进行单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）；demuxlet去多重，Seurat/Signac分析，peak-to-gene linkage、chromVAR、DESeq2、GWAS整合和分层LD分数回归（LDSC）。

研究结果如下。

类风湿关节炎患者循环CD4⁺ T细胞异质性：通过10x Genomics Epi Multiome分析14,625个核（7,997未刺激、6,628刺激），加权最近邻识别11个群体，注释为naive、memory、active、resting、Th2和调节性T细胞（Treg）；共118,387个开放染色质峰。rRA中Th1样记忆和RASA3⁺静息细胞显著富集；多个群体在rRA上调基因更多；较大naive群上调肌动蛋白结合和细胞命运决定负调控基因，较小naive 2群富集组蛋白去甲基化。结论：疾病阶段影响细胞组成和基因表达。

定义调控蓝图：顺式元件和关键基因控制器：通过peak-to-gene linkage识别12,516个连接，89.4%峰无连接，58.2%连接最近基因；BACH2为连接最多的高度调控基因（HRG，67个连接）。eRA和rRA分别14,907和15,002个连接；eRA中CAMK2D、CBLB、ICOS、RBPJ、SATB1、LRRN3连接更多，SATB1为24 vs 9，CCR2为12 vs 0；rRA初始CD4⁺ T细胞FOXP1连接和表达减少，初始Treg中ICOS连接和表达减少。结论：疾病阶段存在特异调控互作。

调控枢纽：顺式元件及其基因靶点：通过对差异可及峰k-means聚类，发现群体特异调控模块和TF motif；rRA模块通路更多且分散，eRA独特通路集中在免疫启动（T细胞活化、γδ T细胞分化、IFNγ和CD40信号），rRA独特通路偏向慢性炎症管理（细胞因子产生正调控、蛋白磷酸化负调控、蛋白合成和代谢改变）；ZBTB7B（ThPOK）在rRA模块6独特富集。结论：rRA调控景观更异质活跃，支持慢性炎症。

差异TF活性及推定靶基因：通过TF motif活性与表达相关，识别19个活性TF，14个高置信；rRA中BACH1、CREM、FOSL1、SMAD2、RUNX2、STAT1活性增加。BACH1和STAT1显示阶段特异靶基因：eRA分别限制 prolonged T细胞活化/凋亡和平衡IFN-γ/IL-10，rRA转向IL-1/IFN-γ、ERK、磷酸酶和Th17。Open Targets查询发现rRA独有14个药物靶基因，LGALS3在部分rRA群独特靶向且高表达。结论：TF活性重编程。

对刺激的差异反应：通过刺激反应基因分析，4个群体差异显著，仅较大naive和Th1样群有足够基因做基因本体（GO）分析；rRA naive中免疫突触、T细胞受体（TCR）信号、肌动蛋白重塑和增殖基因下调钝化，BIRC2预刺激升高；Th1样中eRA刺激上调cadherin结合/JNK，rRA下降，另一簇rRA基线高TNF、ER应激和T细胞无反应性。Motif分析显示eRA naive富集STAT3、STAT1、FOS::JUN、CREB1、ATF3，Th1样eRA富集RUNX3、STAT1、FOXO4、KLF4、FOXP3；rRA Th1样FOXO4富集丢失。结论：rRA去敏化/慢性激活。

RA风险变异的功能注释：通过共识peak-to-gene连接26,345个，2,818个变异中87个单核苷酸多态性（SNP）重叠CRE，CRE显著富集RA GWAS变异（OR 1.59，p<0.001）；LDSC显示刺激CRE解释16.2% SNP遗传力，未刺激7.4%；32个位点占RA GWAS位点20.2%。ACOXL区域刺激后连接BCL2L11，PRKCH区域刺激后连接HIF1A；rRA特异CRE见于TRAF1、PTGER4、RBM17、MAP4K2、DGKH。结论：CD4⁺ T细胞CRE与RA遗传易感相关并优先候选基因。

讨论部分总结：讨论强调尽管总体调控模式和细胞比例相似，naive CD4⁺ T细胞在rRA持续显示转录预激活、调控改变和刺激反应失调；FOXP1/ICOS/CCR2连接减少，ZBTB7B维持helper-memory表型，BIRC2生存信号，STAT1/STAT3耦合改变，FOXO4丢失解除刹车；LGALS3和HIF1A具治疗潜力，rRA特异CRE位于TRAF1和MAP4K2。局限性包括样本量小、仅血液、单一刺激条件和治疗史可能留下“免疫瘢痕”，需更大纵向队列验证。研究结论翻译如下：总之，该研究表明eRA和rRA中CD4⁺ T细胞具有不同调控和转录特征，初始CD4⁺ T细胞持续显示可能与治疗难治性疾病相关的改变。尽管疾病阶段间总体调控模式大致相似，rRA以基因表达失调、刺激反应改变和转录因子活性重连为标志，尤其在初始群体中。这些变化与从急性免疫激活向更持续慢性炎症状态转变一致，后者可能与治疗抵抗相关。这些结果需在更大研究中重复，并突出转录程序和推定药物靶点，可能为未来旨在恢复rRA免疫调节的治疗策略提供基础。