《Colloids and Interfaces》：Stromal Protein from Jumbo Squid as a Natural Emulsifier for Cinnamon Essential Oil Emulsions: Effects of High-Intensity Ultrasound on Physicochemical Properties and Antioxidant Activity
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海洋基质蛋白（stromal protein）是开发功能性乳液的一种有前景但尚未充分开发的天然乳化剂来源。本研究探讨了高强度超声（high-intensity ultrasound, HIU）对以巨型鱿鱼（Dosidicus gigas）外套膜提取的基质蛋白与
海洋基质蛋白（stromal protein）是开发功能性乳液的一种有前景但尚未充分开发的天然乳化剂来源。本研究探讨了高强度超声（high-intensity ultrasound, HIU）对以巨型鱿鱼（Dosidicus gigas）外套膜提取的基质蛋白与肉桂精油配制的乳液在理化特性、界面性质及抗氧化性能方面的影响。研究评估了超声处理时间（0、3、5和10 min）和振幅（40%、70%和100%）两个参数。通过持油能力（oil-holding capacity, OHC）、粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）、Zeta电位及流变行为评价了乳液的理化及胶体性质；同时，采用DPPH、ABTS、FRAP及红细胞溶血抑制试验测定了抗氧化性能。HIU显著改善了乳液的理化性质。乳液的Z-平均液滴直径范围为195.3 ± 1.5至368.7 ± 4.0 nm。在5 min和70%振幅条件下处理获得了最小液滴（195.3 ± 1.5 nm），与未处理乳液（268.7 ± 4.6 nm）相比约减小27%，同时获得最低的PDI（0.215 ± 0.026）和?15.8 ± 0.4 mV的Zeta电位。超声还改善了油的保留能力并增强了抗氧化性能，但响应幅度取决于所采用的测定方法。所制备的乳液对AAPH诱导的红细胞溶血抑制率约为77%–95%，其中在40%振幅下处理10 min时观察到的抑制率最高。总体而言，HIU增强了鱿鱼基质蛋白的界面功能性，支持其作为天然乳化剂在蛋白质基抗氧化递送系统中的潜在应用。
一、研究背景与意义
氧化应激是食品体系和人体健康领域共同关注的重要问题，它与营养物降解、感官品质劣化以及慢性退行性疾病的发生密切相关。氧化应激源于活性氧（reactive oxygen species, ROS）与抗氧化防御机制之间的失衡，可导致脂质、蛋白质和核酸的氧化。在食品体系中，氧化反应损害理化稳定性和货架期；在生物体系中，则促进炎症和退行性疾病的发生。因此，天然抗氧化剂的引入作为合成防腐剂的替代方案日益受到关注。
精油因富含酚类化合物而成为一类有前景的天然抗氧化剂。肉桂（Cinnamomum spp.）精油含有肉桂醛和丁香酚等生物活性成分，已显示出显著的抗氧化能力和在功能性食品及营养保健品中的应用潜力。然而，其疏水性和高挥发性限制了其在水相体系中的稳定性和生物利用度。乳液因此成为亲脂性生物活性化合物的有效递送系统。
乳液是热力学不稳定体系，其稳定性在很大程度上依赖于形成坚固的界面层。蛋白质基乳化剂因其能够在油-水界面吸附并形成兼具空间位阻和静电稳定的黏弹性界面膜而备受关注。海洋来源蛋白作为可持续的功能性生物聚合物日益引起研究兴趣。其中，从巨型鱿鱼（Dosidicus gigas）外套膜提取的基质蛋白主要由胶原蛋白组成，已证明具有自由基清除和金属螯合活性。尽管超声辅助乳化已在乳蛋白、大豆蛋白等体系中得到广泛研究，但关于富含胶原的海洋基质蛋白在乳化过程中对声空化效应的响应知之甚少。
高强度超声（high-intensity ultrasound, HIU）是一种绿色节能的蛋白质稳定乳液制备技术。声空化产生强烈的剪切力、湍流和局部压力梯度，促进乳化过程中的液滴破碎。然而，HIU加工参数如何影响以鱿鱼基质蛋白和肉桂精油配制的乳液的理化、胶体及抗氧化性质仍不清楚。本研究因此系统评估了HIU处理时间和振幅对这些性质及所得乳液抗氧化活性的影响。
二、主要技术方法
研究人员从墨西哥索诺拉州埃莫西约当地海鲜供应商获取巨型鱿鱼外套膜组织，在?20 °C条件下储存。蛋白质提取采用0.1 N NaOH溶液以1:5（w/v）比例混合匀浆，4 °C持续搅拌24 h后离心收集基质蛋白沉淀。持油能力（oil-holding capacity, OHC）测定采用冻干蛋白与肉桂精油混合后经HIU处理、离心称重计算。乳液制备以基质蛋白水分散液（1 mg/mL，pH约9.0）为水相，食品级锡兰肉桂叶精油为油相，水油比20:1（v/v），油相分数4.76%（v/v），先经高速匀浆（10,000 rpm，2 min）后采用Branson Digital Sonifier SFX 550超声处理器（20 kHz，钛探头直径1.27 cm）进行HIU处理，冰浴控温。表征方法包括：动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测定Z-平均水合直径和PDI；电泳光散射测定Zeta电位；MCR 102旋转流变仪（同心圆筒几何，25 °C，剪切速率0.1–300 s?1）测定流变性质并拟合幂律模型；化学抗氧化测定采用DPPH、ABTS和FRAP三种方法；生物抗氧化评价采用AAPH诱导的红细胞溶血抑制试验（经索诺拉州总医院伦理批准，CI 2023-47）。统计分析采用方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验（p < 0.05），每组三个独立实验重复。
三、研究结果
3.1 持油能力
与未处理对照（约10 mL oil/g样品）相比，HIU显著提高了基质蛋白的持油能力，超声处理样品范围为22至42 mL oil/g样品。在100%振幅、10 min条件下获得最高OHC，较对照增加约320%。超声效应同时依赖于振幅和处理时间：在3和5 min时，振幅从40%增至70%导致OHC显著增加，进一步增至100%仅产生轻微改善；而在10 min时，OHC随振幅增加而逐步上升。
3.2 Z-平均水合直径
未处理乳液的Z-平均水合直径为269 ± 5 nm。HIU响应呈非线性。在70%振幅、5 min条件下获得最小Z-平均直径（195.3 ± 1.5 nm），较对照减少约27%。在100%振幅下处理5和10 min反而获得较大的Z-平均直径（分别为317.3和346.2 nm），表明增加振幅并不必然促进液滴进一步减小，这可能与液滴破碎与再聚结之间的竞争有关。
3.3 多分散指数
PDI范围为0.215至0.406。在70%振幅、5 min条件下获得最低PDI（0.215 ± 0.026），表明液滴尺寸分布较窄。低能量处理（3 min—40%和5 min—40%）及长时间超声（10 min）均观察到较高的PDI值，反映了分散相更大的异质性。
3.4 Zeta电位
所有乳液的Zeta电位范围为?14.9至?18.8 mV，均呈负表面电荷，可能与界面基质蛋白中天冬氨酸和谷氨酸等酸性氨基酸残基的电离有关。超声处理引起的Zeta电位变化相对较小。最负值出现在40%振幅、10 min处理（?18.8 ± 0.2 mV）。值得注意的是，获得最小液滴和最低PDI的70%—5 min处理并未具有最高的绝对Zeta电位，表明液滴尺寸减小并非仅由静电排斥决定，蛋白界面层的空间位阻效应同样发挥重要作用。
3.5 流变特性
所有样品均表现出非牛顿流体行为，实验数据良好拟合幂律模型（R2 = 0.969–0.984），稠度系数（K）范围为2.16 × 10?4至5.25 × 10?4 Pa·sn，流动行为指数（n）为1.24至1.40。由于所有n值均大于1，乳液呈现胀流型（剪切增稠）行为。超声处理乳液在整个剪切速率范围内表现出更高的剪切应力，且随处理时间增加而更显著。10 min—70%和100%处理获得最高剪切应力值，表明长时间超声促进了蛋白包覆液滴间的更强相互作用和更紧密的胶体网络形成。
3.6 抗氧化活性
3.6.1 DPPH试验：大多数超声处理产生的抗氧化活性与对照相当，但在70%和100%振幅下长时间超声获得最高DPPH值（约210 μM Trolox当量），显著超过对照。DPPH响应与超声条件呈非线性关系，5 min—100%处理反而表现出最低的DPPH清除活性。
3.6.2 ABTS试验：3 min—40%、5 min—40%、10 min—40%和10 min—100%处理获得最高ABTS值（约128–132 μM Trolox当量），显著超过对照。与DPPH不同，ABTS活性在大多数处理间保持相对稳定，这可能与ABTS自由基对亲水和亲脂抗氧化剂均能反应有关。
3.6.3 FRAP试验：大多数超声处理乳液的还原力高于未处理对照。3 min—70%和10 min—100%处理获得最高FRAP值（约9.0 μM Trolox），显著超过对照。FRAP试验对超声处理表现出比DPPH和ABTS更广泛的正向响应，表明电子转移机制对处理强度不如自由基清除机制敏感。
3.7 红细胞溶血抑制
所有乳液均表现出显著的红细胞保护活性，溶血抑制率约为77%–95%。10 min—40%处理获得最高保护效果（接近95%抑制），显著超过未处理对照。值得注意的是，具有最高红细胞保护活性的处理（10 min—40%）并非产生最小液滴或最高化学抗氧化活性的处理，表明生物体系中的抗氧化性能不能仅由化学抗氧化试验预测，还取决于抗氧化分子在膜内的定位、在脂质双层中的流动性及中断脂质过氧化的能力。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，HIU改善乳液性能的机制可能涉及声空化对蛋白聚集体的破坏、疏水区域暴露增加以及蛋白在新生油-水界面的吸附增强，但研究未直接表征蛋白构象变化和界面吸附行为，这些机制应视为基于文献的可能解释而非实验证实的效果。研究还强调，液滴尺寸的最终结果由液滴破碎与再聚结之间的平衡决定，而非仅由能量输入决定。抗氧化性能的增强主要归因于超声改善了肉桂精油的分散性和可及性，而非改变了其固有抗氧化能力。
结论部分总结：高强度超声显著影响了以D. gigas外套膜基质蛋白和肉桂精油配制的乳液的理化、胶体、流变和抗氧化响应。在评估条件中，70%振幅、5 min处理获得了数值上最小的平均液滴尺寸（195.3 ± 1.5 nm）和最低PDI（0.215 ± 0.026），表明在该测量条件下形成了相对较小且窄的液滴尺寸分布。然而，各配方间观察到的PDI值表明，液滴尺寸异质性仍是评估这些体系物理稳定性时的重要考量因素。抗氧化响应因分析方法不同而异。在红细胞模型中，乳液对AAPH诱导的溶血抑制率约为77%–95%，在体外生物体系中提供了膜保护活性的证据。研究也指出了局限性：建议未来研究考察乳液在储存期间的物理稳定性，监测液滴尺寸变化和宏观相分离，并采用光学或共聚焦激光扫描显微镜进行微观表征，以补充液滴形态、尺寸异质性及可能的聚集或聚结信息。此外，消化、安全性、感官特性和可持续性研究也是确立这些乳液在食品或营养保健品应用适用性之前所必需的。
