miR-7a-5p通过抑制PARP1介导的parthanatos减轻缺氧缺血性脑病

《iScience》：miR-7a-5p attenuates hypoxic-ischemic encephalopathy by suppressing PARP1-mediated parthanatos

　　

缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是导致严重新生儿脑损伤的疾病，PARP1过度激活参与神经元死亡。研究人员利用大鼠HIE模型和谷氨酸暴露的HT22神经元，发现miR-7a-5p在HIE大鼠的外周血和损伤皮层中均显著下调。PARP1过度激活触发parthanatos，其特征为PAR聚合物积累和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor, AIF）核转位，而不激活caspase依赖性凋亡。荧光素酶实验证实miR-7a-5p直接靶向PARP1的3^′UTR，抑制其表达。外源性miR-7a-5p可减少HIE大鼠的梗死体积，改善神经形态，并保护神经功能恢复。体外实验中，miR-7a-5p过表达或药物性PARP1抑制可减轻谷氨酸诱导的神经元死亡、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）丧失、活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生及PAR/AIF失调。关键的是，PARP1激动剂MNNG可逆转miR-7a-5p介导的神经保护作用，确立了miR-7a-5p/PARP1轴的不可或缺性。miR-7a-5p是parthanatos的关键调节因子，通过抑制PARP1过度激活、减轻线粒体功能障碍，为HIE提供治疗靶点。

缺氧缺血性脑病（HIE）是围产期缺氧缺血所致的新生儿严重脑损伤，也是新生儿死亡和长期神经发育障碍的主要原因，全球发病率为1‰～8‰，约15%的患儿在生后第一周内死亡，40%的存活者遗留永久性神经功能缺损，如脑瘫、认知障碍、感觉异常、行为障碍和癫痫等。目前临床上仅有亚低温治疗被证实有效，但接受治疗后仍有约50%的婴儿死亡或遗留永久性神经行为及认知功能障碍。MicroRNA（miRNA）是关键的转录后调控因子，在围产期脑损伤和HIE病理中发挥重要作用。已有研究显示miR-499-5p、miR-210、miR-146b-5p等参与HIE的损伤与保护过程，但miR-7a-5p在HIE缺氧缺血损伤中的功能尚不清楚。多聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP1）过度激活可导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）耗竭，诱导线粒体释放凋亡诱导因子（AIF），启动parthanatos——一种caspase非依赖性、PARP1介导的程序性坏死，与脑缺血和神经退行性疾病密切相关。尽管parthanatos已被发现与缺血性脑损伤有关，但其在HIE病理中的贡献及miRNA调控机制仍不明确。本研究旨在验证两个相互关联的假说：parthanatos主导HIE中的神经元死亡，且miR-7a-5p/PARP1轴在缺氧缺血条件下调节该过程。

研究人员首先从GEO数据集GSE121178（包含3例HIE患者和3例正常对照的人全血样本）中进行差异miRNA表达分析，发现miR-7-2显著下调，其加工后的成熟体miR-7a-5p被选为候选靶点。在体内实验中，研究人员采用P7雄性Sprague-Dawley大鼠制备HIE模型（单侧颈动脉结扎联合8% O₂暴露3.5小时）；在体外实验中，使用谷氨酸（5 mM，12小时）诱导HT22神经元氧化应激损伤。通过荧光素酶报告基因实验验证miR-7a-5p与PARP1 3^′UTR的直接结合。研究人员采用miR-7a-5p agomir脑室内注射、慢病毒介导的miR-7a-5p过表达、PARP1抑制剂PJ34和PARP1激动剂MNNG等干预手段，评估细胞活力、线粒体功能、PAR/AIF通路指标及动物行为学变化。主要技术方法包括：生物信息学差异表达分析（limma包）、实时PCR、Western blot、荧光素酶报告基因、TTC染色、电子显微镜、免疫荧光、流式细胞术（凋亡和ROS检测）、JC-1线粒体膜电位检测、ATP测定以及行为学测试（翻正反射、斜面实验、平衡木测试和新物体识别测试）。

研究结果分述如下：

**HIE患者差异表达miRNA谱**：从GSE121178中提取3例HIE患者和3例对照的全血样本，经标准化和PCA分析确认样本质量可靠；共筛选出40个差异表达miRNA，其中miR-7-2在HIE患者中显著下调，经文献筛选确定为后续研究对象。

**缺氧缺血损伤HIE大鼠的运动功能**：翻正反射实验显示模型组大鼠从P9至P11翻正时间明显延长；斜面实验中模型组能保持的最大角度显著减小；平衡木测试中模型组通过时间更长且后肢滑落次数更多，表明HI导致运动协调和平衡能力受损。

**miR-7a-5p靶向PARP1且parthanatos主导HIE神经元死亡**：实时PCR证实HIE大鼠损伤皮层和外周血中miR-7a-5p表达下调；TargetScan预测并经荧光素酶报告实验证实miR-7a-5p可直接结合PARP1 mRNA的3^′UTR并抑制其表达。Western blot显示HIE大鼠皮层PARP1过度激活，PAR和AIF水平升高，而凋亡标志物cleaved-PARP1与对照组无差异；电镜显示损伤皮层神经元内线粒体数量减少、肿胀、嵴结构破坏，符合parthanatos驱动的损伤特征，提示parthanatos是HIE中神经元死亡的主要途径。

**miR-7a-5p agomir减轻HI大鼠脑损伤并改善脑功能**：HI后6小时脑室内注射miR-7a-5p agomir，48小时TTC染色显示梗死体积较模型+NC组显著减小；电镜显示皮质神经元线粒体损伤和染色质凝集减轻；新物体识别测试中，模型+NC组探索新物体时间比例显著低于对照组，而模型+AG组显著高于模型+NC组，表明miR-7a-5p可减轻脑损伤并促进认知功能恢复。

**L-谷氨酸触发HT22细胞parthanatos**：5 mM L-谷氨酸孵育12小时可有效诱导HT22细胞死亡、ROS升高和线粒体膜电位下降；铁死亡标志物GPX4/ACSL4及坏死性凋亡标志物p-RIP3/p-MLKL均无显著变化，排除这两种死亡方式。谷氨酸处理后HT22细胞miR-7a-5p表达下调，PARP1、PAR、AIF总表达升高，细胞核内AIF和MIF水平增加，表明发生parthanatos。

**药理抑制PARP1减轻谷氨酸诱导的parthanatos**：PARP1抑制剂PJ34预处理可浓度依赖性减轻谷氨酸诱导的细胞死亡，并降低ROS过量产生和ATP过度消耗，同时抑制PAR形成和AIF核转位，进一步证实parthanatos在谷氨酸兴奋毒性损伤中的关键作用。

**miR-7a-5p过表达减轻HT22细胞parthanatos**：慢病毒介导的miR-7a-5p过表达可显著提高谷氨酸处理后的细胞活力，减少细胞死亡，防止MMP丢失并降低ATP消耗；同时降低PARP1和AIF蛋白水平，减少PAR积累及AIF核定位，表明miR-7a-5p可有效抑制parthanatos。

**miR-7a-5p以PARP1依赖方式减轻parthanatos**：PARP1激动剂MNNG预孵育可逆转miR-7a-5p过表达对细胞活力和细胞毒性的保护效应，证明miR-7a-5p的神经保护作用依赖于PARP1，miR-7a-5p/PARP1轴在该通路中具有不可或缺的作用。

讨论部分指出，parthanatos是HIE神经元死亡的核心机制，其特征为PAR聚合物积累、AIF核转位、线粒体损伤和能量耗竭，且不依赖caspase凋亡。谷氨酸诱导的HT22细胞模型重现了该级联反应，PJ34抑制实验证实了PARP1在驱动该损伤表型中的中心作用。研究人员发现miR-7a-5p通过直接靶向PARP1的3^′UTR抑制其表达，从而降低PARP1过度激活的阈值并阻断parthanatos。MNNG逆转实验确立了miR-7a-5p/PARP1轴的线性因果关系。此外，讨论还提及miR-7a-5p在胶质细胞中的潜在功能，如通过NLRP3抑制或内质网应激调节减轻神经炎症，但本研究主要聚焦于神经元的保护作用。增强miR-7a-5p活性可能作为亚低温的辅助治疗策略，相比直接PARP1抑制剂，miRNA调节可能保留PARP1的基础DNA修复功能；HIE大鼠外周血中miR-7a-5p的持续降低也提示其可作为预后或药效生物标志物。

研究结论翻译如下：新生儿缺氧缺血损伤所致的运动和认知缺陷主要由PARP1介导的parthanatos驱动；这种占主导地位的细胞死亡通路可被miR-7a-5p通过直接靶向PARP1所抑制，从而使miR-7a-5p成为缓解HIE神经及认知损伤的潜在治疗靶点。