靶向胶质瘢痕的肝细胞生长因子衍生肽CAQK-H-RN通过p38 MAPK/Elk-1/Egr-1–ASMase轴减轻溶酶体膜透化并促进脊髓损伤修复

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Glial Scar-Targeted Modification of Hepatocyte Growth Factor-Derived Peptide for Spinal Cord Injury Therapeutic Repair

　　

脊髓损伤（SCI）导致不可逆的神经损伤和功能障碍。H-RN是一种来源于肝细胞生长因子kringle 1结构域的短肽。尽管其在抑制炎症反应方面有效，但H-RN在SCI中的精确神经保护机制仍不清楚。短肽CAQK可靶向SCI损伤中心。为探索H-RN在SCI中的作用并解决传统药物治疗面临的诸多挑战，本研究开发了一种合成肽CAQK-H-RN。研究结果显示，CAQK-H-RN可穿过血–脊髓屏障，精确靶向SCI区域，并增加损伤部位药物蓄积，从而减少胶质瘢痕形成、降低运动神经元死亡并促进SCI后功能恢复。研究人员通过RNA测序探索CAQK-H-RN在SCI中的分子机制，发现CAQK-H-RN抑制焦亡并改善SCI后神经元中溶酶体膜透化（LMP）诱导的自噬流障碍。此外，CAQK-H-RN通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）/Ets样蛋白-1（Elk-1）/早期生长反应蛋白1（Egr-1）信号级联抑制酸性鞘磷脂酶（ASMase）活性，从而减轻LMP，并随后增强自噬，进而减轻神经元死亡。这种以合成肽CAQK-H-RN为核心的静脉治疗系统有助于SCI的功能恢复，可能临床应用于脊髓修复。

研究背景与科学问题：脊髓损伤（SCI）是严重致残性神经系统疾病，可导致感觉、运动及自主神经功能障碍，严重者出现永久性瘫痪并显著降低生活质量和预期寿命。SCI分为原发性和继发性损伤，原发性损伤为机械力造成的即刻组织损伤，继发性损伤涉及缺血、氧化应激、神经炎症和神经元死亡等病理级联。由于原发性损伤不可逆且难以预测，当前治疗主要针对继发性病理事件。然而，临床可用的甲泼尼龙仅主要缓解急性期炎症，许多候选药物受损伤部位滞留时间短、局部蓄积不足、缺乏控释、血–脊髓屏障限制及对损伤微环境中特定细胞群靶向不足等因素制约，静脉给药后到达SCI部位的有效药物浓度很低。焦亡（pyroptosis，一种炎症性程序性细胞死亡）由炎性小体尤其是NLRP3炎性小体激活、caspase-1切割、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）成熟及gasdermin D（GSDMD）N端成孔等过程驱动，在SCI继发性损伤中加重神经炎症和神经元死亡。自噬是依赖溶酶体的降解机制，可清除受损细胞器和聚集蛋白，对中枢神经系统损伤具有神经保护作用；溶酶体膜完整性对自噬流（autophagic flux）至关重要，溶酶体膜透化（LMP，溶酶体膜完整性受损导致酶泄漏）会破坏自噬过程并促进细胞死亡。酸性鞘磷脂酶（ASMase，可将鞘磷脂转化为神经酰胺）位于溶酶体内膜，其活性升高促进神经酰胺和鞘氨醇生成，进而诱导LMP；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）可通过Ets样蛋白-1（Elk-1）/早期生长反应蛋白1（Egr-1）转录轴上调Smpd1基因及ASMase表达。肝细胞生长因子（HGF）具有神经营养、促再生、抗炎等作用，但作为大分子蛋白存在半衰期短、血–脑屏障通透性有限和递送系统不足等问题。H-RN是来源于HGF kringle 1结构域的短肽，具有抗炎作用；CAQK（阳离子半胱氨酸–丙氨酸–谷氨酰胺–赖氨酸）短肽可高亲和、特异靶向SCI病灶中心富含蛋白聚糖区域。研究人员首次合成CAQK-H-RN，旨在明确其是否选择性靶向SCI损伤部位、促进神经元保护与运动功能恢复，并探讨自噬、LMP和焦亡是否介导其神经保护作用，以及ASMase和p38 MAPK通路是否参与其获益。研究结论提示，CAQK-H-RN可跨血–脊髓屏障、精准靶向SCI区域并增加损伤部位蓄积，减少胶质瘢痕形成和运动神经元死亡、促进功能恢复；机制上抑制焦亡并改善LMP诱导的自噬流障碍，且通过p38 MAPK/Elk-1/Egr-1信号级联抑制ASMase活性、减轻LMP、增强自噬，从而减轻神经元死亡。该静脉治疗系统为SCI修复提供了有临床转化潜力的候选策略。

主要关键技术方法（≤250字）：采用固相法合成H-RN与CAQK-H-RN并经HPLC和质谱质控；建立雌性C57BL/6J小鼠T9–T10脊髓打击模型；给予AAV-ASMase/AAV-Blank脊髓内注射及氯喹（CQ）、积雪草酸（AA）干预；以Basso小鼠量表（BMS）、足迹和DeepLabCut运动学评估运动功能；开展HE/Masson染色、免疫荧光、Western blot、qPCR、ELISA酶活、溶酶体富集亚细胞分离、RNA测序、Cy5.5体内成像和毒性评估；单核RNA测序数据来自GEO数据库（GSE172167，雌性C57BL/6小鼠未损伤及伤后1 d、1周、3周、6周样本，n=15）。

研究结果：
1. 合成肽CAQK-H-RN靶向损伤脊髓：通过剂量筛选确定300 μg/kg最有效，组织学及体重、肝酶、肌酐评估未见明显异常；采用Cy5.5标记肽尾静脉注射和活体成像，发现C-H-RN在损伤部位荧光蓄积高于未修饰H-RN，离体脊髓定量一致，肝、脾、肾信号降低；纵切免疫荧光显示Cy5.5主要与NeuN⁺神经元共定位，与GFAP⁺星形胶质细胞和Iba1⁺小胶质细胞共定位较少，并与CSPG和NeuN共定位增加；RNA测序发现381个差异基因（106个上调、275个下调），GO富集涉及溶酶体、自噬、焦亡和MAPK通路。结论：CAQK修饰增强病灶靶向和神经元蓄积，其治疗机制可能涉及焦亡、自噬和MAPK通路。
2. CAQK-H-RN促进SCI后功能恢复：通过NF-H/GFAP免疫荧光发现CAQK-H-RN增加NF-H荧光、降低GFAP免疫反应，提示促进轴突再生和减少胶质瘢痕；MAP2、SYN和NeuN染色显示其保留前角运动神经元、提高MAP2免疫反应和增加运动神经元上SYN⁺突触；HE和Masson染色显示减少胶质瘢痕面积；足迹、步长、拖趾和BMS评分显示运动功能改善；DeepLabCut运动学分析显示踝、膝、髋关节活动及后肢支撑能力改善。结论：CAQK-H-RN促进SCI小鼠组织修复和运动功能恢复。
3. CAQK-H-RN减轻SCI后神经元焦亡并增强神经元自噬：通过caspase-1/NeuN和GSDMD-N/NeuN双免疫荧光发现CAQK-H-RN降低神经元caspase-1和GSDMD-N信号；Western blot显示NLRP1、NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD-N、IL-18和ASC水平下降；DHE染色显示活性氧降低；p62/NeuN和LC3/NeuN免疫荧光显示神经元SQSTM1/p62降低、LC3 II斑点减少；Western blot显示CTSD、VPS34、Beclin-1升高，SQSTM1/p62、LC3 II和总LC3降低。结论：CAQK-H-RN抑制神经元焦亡并增强自噬–溶酶体通路。
4. 抑制自噬削弱CAQK-H-RN对神经元焦亡的抑制和功能恢复：通过CQ干预发现，CQ增加SQSTM1/p62和LC3 II，Beclin-1和VPS34无显著变化，提示阻断自噬降解；CQ增加caspase-1和GSDMD-N及焦亡相关蛋白，部分逆转CAQK-H-RN对焦亡的抑制；组织学和运动评估显示CQ减少前角运动神经元、降低NF-H、增加GFAP、降低MAP2和SYN⁺突触、扩大胶质瘢痕并降低BMS评分和足迹表现。结论：CAQK-H-RN的神经保护和功能恢复获益依赖自噬激活。
5. CAQK-H-RN减轻SCI后LMP并抑制神经元ASMase活性：通过溶酶体富集亚细胞分离和Western blot发现SCI后胞质中CTSL、CTSB、CTSD升高而溶酶体组分降低；CTSB/NeuN免疫荧光显示神经元内CTSB由点状变为弥漫分布，CAQK-H-RN恢复溶酶体酶定位；ASMase蛋白、mRNA和酶活性在SCI后升高，CAQK-H-RN较H-RN更有效抑制；GEO单核RNA测序数据提示ASMase分布于星形胶质细胞、神经元、少突胶质前体细胞和少突胶质细胞，神经元可能是主要来源。结论：SCI诱导神经元LMP，CAQK-H-RN减轻LMP并抑制ASMase活性。
6. CAQK-H-RN通过抑制ASMase减轻LMP、增强自噬并抑制焦亡：通过AAV-ASMase过表达神经元ASMase，发现其逆转CAQK-H-RN对胞质溶酶体酶泄漏、CTSB弥漫分布、ASMase活性、CTSD和NAGLU酶活性分布、DHE荧光、GSDMD-N和caspase-1、SQSTM1/p62、LC3 II以及NF-H/GFAP、胶质瘢痕、运动神经元、MAP2、SYN⁺突触、足迹和BMS评分的改善。结论：CAQK-H-RN通过抑制ASMase减轻LMP、增强自噬、抑制焦亡并促进功能恢复。
7. CAQK-H-RN通过p38 MAPK通路抑制ASMase活性：通过Western blot发现SCI后ASMase、p38、ERK1/2和JNK激活，CAQK-H-RN降低ASMase表达和p-p38/p38比值，而不改变p-ERK1/2/ERK1/2和p-JNK/JNK；分子对接显示CAQK-H-RN与MAPK11存在氢键、疏水作用和π–cation相互作用；AA激活p38后增加p-p38/p38和ASMase，并逆转CAQK-H-RN对焦亡、自噬、ASMase活性和溶酶体膜稳定性的保护作用。结论：CAQK-H-RN经p38 MAPK/Elk-1/Egr-1信号轴抑制ASMase活化并减轻LMP。

讨论部分总结：研究人员首次合成CAQK-H-RN并经静脉给药实现SCI病灶精准靶向，提高损伤部位药物蓄积并发挥神经保护作用。HGF具有神经营养和再生作用，但大分子应用受限；H-RN来源于HGF kringle 1结构域并保留抗炎活性，短肽便于模块化工程化和规模化合成；CAQK可识别损伤部位上调的CSPG，实现病灶选择性蓄积并减少非靶组织分布，较广泛中枢神经系统递送肽和细胞穿透肽具有损伤选择性和较低非特异摄取优势。讨论指出，CAQK-H-RN是否完全依赖c-Met仍待明确；焦亡、自噬和LMP共同参与SCI继发损伤，CAQK-H-RN促进自噬流并抑制神经元焦亡，CQ可部分逆转其获益；ASMase是连接CAQK-H-RN、溶酶体功能、自噬和炎症性细胞死亡的关键分子靶点，p38 MAPK/Elk-1/Egr-1轴参与ASMase转录调控。临床转化前仍需评估肽稳定性、循环半衰期、降解动力学、体内分布、MAPK通路交互、药代比较、联合递送及临床试验；研究局限包括未排除自噬体–溶酶体融合缺陷、需延长观察时点、c-Met依赖性和其他细胞类型作用未明、仅使用雌性小鼠而性别差异仍需评估。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现提供有力证据表明，合成肽CAQK-H-RN通过特异性靶向损伤部位并抑制p38 MAPK/Elk-1/Egr-1信号轴，有效抑制SCI后神经元ASMase表达。随后ASMase活性降低减轻LMP、恢复自噬流，并因此减少神经元焦亡。这些累积效应支持CAQK-H-RN作为改善SCI患者结局的有前景候选。研究流程概述显示，CAQK-H-RN经静脉注射后靶向递送至SCI部位，作用于神经元发挥神经保护作用并促进轴突再生，从而促进SCI后运动功能恢复。总体而言，本研究提供新的临床前见解，支持CAQK-H-RN作为SCI前瞻性治疗干预，并强调需要额外研究以促进其临床转化。