在缺乏先天淋巴样细胞的情况下，微生物和TNF驱动结肠炎

《iScience》：Microbes and TNF drive colitis in the absence of innate lymphoid cells

　　亮点
• 在缺乏IL-15Rα依赖性ILC1和NK细胞的情况下，先天性结肠炎持续存在
• 在缺乏γc?/?信号和所有ILC的情况下，先天性结肠炎持续存在
• 缺乏ILC时的结肠炎由微生物驱动
• 缺乏ILC时的结肠炎需要TNF
摘要
先天性淋巴细胞（ILCs）在免疫功能正常的情况下是维持肠道稳态所必需的细胞因子的重要来源，但其在先天性结肠炎中的必要性仍不清楚。我们利用缺乏适应性免疫的小鼠炎症性肠病（IBD）模型，研究了先天性结肠炎是否依赖于ILCs。缺乏白细胞介素-15受体α的小鼠缺乏肠道ILC1和自然杀伤（NK）细胞，但这些小鼠的先天性结肠炎并未减轻。缺失IL-2受体γ链（可消除所有ILC和NK细胞）同样不能阻止先天性结肠炎。对所有缺乏ILC的小鼠进行抗生素治疗可预防结肠炎。同样，在缺乏所有ILC的情况下，TNF缺乏可预防结肠炎，这表明在缺乏ILC时，TNF是微生物驱动的先天性结肠炎所必需的。这些发现揭示了ILC在先天性结肠炎中是冗余的。在缺乏ILC的情况下研究先天性结肠炎可能有助于理解IBD的机制以及抗TNF疗法的有效性。
图形摘要
引言
先天性淋巴细胞（ILCs）富集于黏膜表面，产生在肠道稳态中起关键作用的细胞因子，并可能加重或保护结肠炎。所有ILC亚群，包括淋巴组织诱导细胞（LTi）、自然杀伤（NK）细胞、ILC1s、ILC2s和ILC3s，均来源于共同淋巴祖细胞，其发育依赖于IL-2受体共同γ链（IL-2Rγ）信号传导，反映了IL-15和IL-7信号在ILC发育中的关键作用。ILC在肠道稳态中的功能包括抗菌防御、诱导上皮屏障功能和伤口修复、产生炎症性和抗炎性细胞因子以及诱导调节性T细胞（Tregs）。ILC1s和NK细胞可通过产生IFN-γ和TNF诱导炎症。ILC2s产生双调蛋白以抵抗肠道寄生虫，并在葡聚糖硫酸钠（DSS）结肠炎模型中促进愈合。相反，ILC2s产生的细胞因子可能促进炎症性肠病（IBD）中的纤维化。ILC3s通过产生IL-22和IL-17提供保护和维持稳态，但也可通过产生IL-17、IFN-γ和GM-CSF促进结肠炎，尤其是在缺乏适应性免疫的情况下。因此，ILCs是肠道健康和IBD的关键介质。矛盾的是，成人缺乏ILC并不与肠道疾病或病原体感染的易感性相关，这表明在适应性免疫细胞功能正常的情况下，这些细胞可能是冗余的。因此，我们测试了在缺乏适应性免疫的情况下自发性发生的小鼠IBD模型是否在缺乏ILC时发生改变。

在小肠上皮细胞中表达绒毛蛋白-肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（villin-TNFAIP3）的小鼠在无特定病原体（SPF）条件下是健康的。然而，它们表现出细菌侵入结肠内黏液层，主要是变形菌门。缺乏RAG1（RAG1?/?）的小鼠没有适应性免疫，但在SPF条件下不表现IBD。然而，将villin-TNFAIP3与RAG1?/?杂交后，villin-TNFAIP3 × RAG1?/?小鼠表现出100%外显率的早发性全结肠炎。villin-TNFAIP3 × RAG1?/?（TRAG）小鼠的结肠炎允许研究自发性先天性结肠炎机制。我们之前已经证明，缺乏RORγt的TRAG小鼠（RORC?/? × TRAG），即缺乏ILC3和其他依赖RORγt的细胞，其结肠炎的严重程度和外显率与TRAG小鼠相当。因此，我们检查了缺乏IL-15Rα依赖性细胞（ILC1s和NK细胞）的TRAG小鼠或缺乏IL-2Rγ信号依赖性细胞（所有ILC和NK细胞）的TRAG小鼠是否免受先天性结肠炎的影响。我们报告，在IL-15Rα?/? × TRAG小鼠中，尽管ILC1和NK细胞显著减少，但结肠炎仍持续存在；在缺乏所有ILC的IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中，结肠炎也持续存在。此外，我们报告IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎是由微生物和TNF驱动的。这表明在成年小鼠中，ILC对于先天性结肠炎是冗余的，并且TNF足以在缺乏适应性免疫和ILC的情况下驱动结肠炎。
结果
先天性结肠炎在缺乏IL-15R依赖性ILC1和NK细胞的情况下持续存在
我们之前发现，缺失RORγt导致ILC3缺失，并不能阻止TRAG小鼠的自发性先天性结肠炎。因此，我们通过产生IL-15Rα?/? × TRAG小鼠，研究了IL-15Rα依赖性ILC（NK细胞和ILC1）是否对TRAG小鼠的结肠炎是必需的。8周龄IL-15Rα?/? × TRAG小鼠的结肠固有层淋巴细胞（LPLs）显示NK细胞和ILC1显著减少，但CD45+ve细胞总数（包括炎症单核细胞、中性粒细胞和其他先天免疫细胞）并未整体减少（图1A–1E）。与此一致，与IL-15Rα+/? × TRAG小鼠相比，8周龄IL-15Rα?/? × TRAG小鼠的结肠炎组织学征象并未减轻（图1F和1G）。TRAG小鼠的结肠炎包括盲肠、近端结肠和远端结肠的显著炎症增加，与RAG1?/?小鼠相比，且这种炎症在缺乏IL-15Rα的情况下持续存在（图1F和1G）。我们在TRAG或IL-15Rα?/? × TRAG小鼠的小肠中未观察到炎症，其CD45+ve细胞、炎症单核细胞和其他先天免疫细胞数量与RAG1?/?小鼠相当（图S1）。与结肠一样，与RAG1?/?或TRAG小鼠相比，IL-15Rα?/? × TRAG小鼠小肠中ILC1和NK细胞数量显著减少（图S1）。这些结果表明，IL-15R信号对于小肠和结肠固有层中正常数量的ILC1是必需的，类似于已知的IL-15Rα对NK细胞、肠上皮淋巴细胞（IELs）和ILC1样IELs的需求。总之，这些结果表明，IL-15Rα和IL-15Rα依赖性细胞（包括固有层NK细胞和ILC1）对于TRAG小鼠的先天性结肠炎是可有可无的。

图1 TRAG小鼠的先天性结肠炎不需要IL-15Rα或IL-15Rα依赖性ILC1或NK细胞
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(A–C) 从RAG1?/?、IL-15Rα+/? × TRAG（TRAG）和IL-15Rα?/? × TRAG小鼠结肠分离的固有层淋巴细胞（LPL）数量，显示总计数（A）CD45+ve细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；（B）ILC亚群；和（C）树突状细胞、嗜酸性粒细胞和未表征细胞类型。
(D和E) 均匀流形近似和投影（UMAP）分析显示（D）先天免疫细胞类型的分布和（E）这些细胞类型在RAG1?/?、TRAG和IL-15Rα?/? × TRAG结肠中的相对浓度。
(F和G) TRAG和IL-15Rα?/? × TRAG小鼠结肠的全结肠炎，通过（F）组织学和（G）组织学评分显示。
每个数据点代表来自一只小鼠的LPL计数或评分（n = 7–9），条形表示平均值±SEM。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.005，????p < 0.001。组织学评分通过单因素方差分析并进行事后非参数检验（Kruskal-Wallis和Dunn多重比较）。LPL数据通过方差分析并进行事后Tukey检验。比例尺，200 μM。

先天性结肠炎在缺乏IL-2Rγ和所有ILC的情况下持续存在
为了评估TRAG小鼠的结肠炎是否依赖于所有ILC，我们将TRAG小鼠与IL-2Rγ?/?（γc?/?）小鼠杂交，后者缺乏所有抗原受体表达细胞（由于缺乏RAG1）和所有依赖γc发育的细胞（包括所有NK细胞和ILC）。8周龄IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎持续存在，与RAG1?/?小鼠相比，盲肠、近端结肠和远端结肠的黏膜炎症组织学征象显著增加（图2A和2B）。与IL-2Rγ+/?或+/o × TRAG小鼠相比，IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎严重程度并未显著降低（图2A和2B）。为了测试这种对ILC的非依赖性是否在其他结肠炎模型中也明显，我们将过继性T细胞转移至IL-2Rγ?/? × RAG1?/?小鼠中，并观察到这些小鼠发生结肠炎（图S5），这与先前在IL-2Rγ?/? × RAG2?/?小鼠中的研究一致。因此，缺失IL-2Rγ导致所有ILC（以及IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的所有信号传导）丧失，并未阻止TRAG小鼠的自发性早发性先天性结肠炎。

图2 TRAG小鼠的先天性结肠炎不需要IL-2Rγ或IL-2Rγ依赖性细胞或细胞因子
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(A和B) IL-2Rγ+/? × TRAG（TRAG）和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠的全结肠炎，通过（A）组织学和（B）组织学评分显示。
(C–E) 从RAG1?/?、TRAG、IL-2Rγ?/? × RAG1?/?和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠分离的固有层淋巴细胞（LPL）数量，显示总计数（C）CD45+ve细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞；（D）ILC亚群；和（E）树突状细胞、嗜酸性粒细胞和未表征细胞类型。
(F和G) UMAP分析显示（F）先天免疫细胞类型的分布和（G）这些细胞类型在RAG1?/?、TRAG、IL-2Rγ?/? × RAG1?/?和IL-2Rγ?/? × TRAG结肠中的相对浓度。
每个数据点代表来自一只小鼠的LPL计数或评分（n = 8–12），条形表示平均值±SEM。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.005，????p < 0.001。组织学评分通过单因素方差分析并进行事后非参数检验（Kruskal-Wallis和Dunn多重比较）。LPL数据通过方差分析并进行事后Tukey检验。比例尺，200 μM。

为了评估IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中促进结肠炎的先天细胞，我们分析了来自RAG1?/?、TRAG、IL-2Rγ?/? × RAG1?/?和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠肠道的LPLs。与RAG1?/?或IL-2Rγ?/? × RAG1?/?小鼠相比，TRAG和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠黏膜中CD45+ve白细胞总数显著增加（图2C–2G）。在小肠中未观察到这种情况，与该组织中缺乏炎症一致（图S2）。结肠炎在雄性和雌性TRAG和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中均明显（图S3）。缺乏IL-2Rγ的小鼠（包括IL-2Rγ?/? × TRAG和IL-2Rγ?/? × RAG1?/?小鼠）表现出预期中所有ILC亚群（包括NK细胞）在结肠和小肠中的缺失（图2D和S2）。TRAG和IL-2Rγ?/? × TRAG结肠黏膜均显示炎症单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和CD11b+CD11c+树突状细胞显著增加（图2C和2E）。因此，在缺乏ILC（包括NK细胞）和IL-2Rγ依赖性信号传导的情况下，IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的先天性结肠炎持续存在。

缺乏ILC时的先天性结肠炎由微生物驱动
我们之前已经证明，微生物驱动TRAG小鼠的结肠炎，并且氨苄青霉素和新霉素治疗足以显著减少微生物并减轻TRAG小鼠的结肠炎。因此，我们通过从4周龄开始用氨苄青霉素和新霉素治疗IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠4周，检查在缺乏ILC和IL-2Rγ信号传导的情况下，微生物是否驱动结肠炎。如前所述，抗生素联合治疗的有效性通过抗生素治疗小鼠的盲肠增大来证明（图S6）。8周龄IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠盲肠、近端结肠和远端结肠的组织学结肠炎征象，在接受饮水中氨苄青霉素和新霉素的IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中显著减弱（图3A和3B）。与此一致，与未接受抗生素的IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠相比，接受抗生素治疗的IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠中CD45+ve白细胞LPL计数显著减少（图3C）。因此，在IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中缺乏ILC时的先天性结肠炎是由微生物驱动的。

图3 缺乏ILC时的先天性结肠炎由微生物驱动
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(A和B) 抗生素治疗IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠对结肠炎的抑制，通过（A）组织学评分和（B）组织学显示。
(C) 抗生素治疗的IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中CD45+ve先天免疫细胞数量减少。
每个数据点代表来自一只小鼠的LPL计数或评分（n = 3–4），条形表示平均值±SEM。?p < 0.05，??p < 0.01。组织学评分通过单因素方差分析并进行事后非参数检验（Kruskal-Wallis和Dunn多重比较）。LPL数据通过方差分析并进行事后Tukey检验。比例尺，200 μM。

缺乏ILC时的先天性结肠炎需要TNF
微生物驱动炎症的主要下游细胞因子效应物是TNF，它由微生物与先天免疫细胞和基质细胞相互作用诱导。我们此前已证明，TRAG小鼠中的结肠炎由TNF驱动，且表达TNF的先天性造血细胞的骨髓移植足以在TNF?/? × TRAG小鼠中驱动结肠炎。因此，我们通过将TNF?/?小鼠与IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠杂交，检验了TNF是否参与IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎。与TNF+/? × IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠相比，8周龄TNF?/? × IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎组织学征象显著减轻（图4A和4B）。同时，与IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠相比，TNF?/? × IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠黏膜中CD45+ve白细胞数量显著减少（图4C）。正如在TRAG小鼠中观察到的，单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的固有层中产生TNF（图S7）。这种TNF产生模式与在IL-15Rα?/? × TRAG和RORC?/? × TRAG结肠中观察到的一致（图S7）。因此，TNF是IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中观察到的自发性、早发性先天性结肠炎所必需的。
图4 缺乏ILC时的先天性结肠炎需要TNF
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（A和B）与IL-2Rγ?/? × TNF+/? × TRAG（IL-2Rγ?/? × TRAG）小鼠相比，IL-2Rγ?/? × TNF?/? × TRAG小鼠的结肠炎得到预防，如（A）组织学评分和（B）组织学所示。
（C）总CD45+ve细胞的LPL计数显示，与IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠相比，IL-2Rγ?/? × TNF?/? × TRAG小鼠的先天性免疫细胞数量减少。
每个数据点代表一只小鼠的LPL计数或评分（n = 4–7），条形表示平均值 ± SEM。?p < 0.05，??p < 0.01。组织学评分通过单因素方差分析及事后非参数检验（Kruskal-Wallis和Dunn多重比较）分析。LPL数据通过方差分析及事后Tukey检验分析。比例尺，200 μM。
总之，这些结果表明，在缺乏ILC（包括NK细胞）和IL-2Rγ信号传导的情况下，先天性结肠炎仍然存在。此外，结果表明微生物和TNF在缺乏ILC和IL-2Rγ信号传导的情况下驱动先天性结肠炎。这与ILC在微生物和TNF驱动的先天性结肠炎中是冗余的概念一致。
讨论
我们最初的研究旨在了解NK细胞和ILC1在TRAG结肠炎中的潜在作用，因为在缺乏ILC3的情况下，TRAG小鼠的结肠炎仍然存在。我们观察到IL-15Rα?/? × TRAG小鼠固有层中ILC1和NK细胞数量显著减少，但这与结肠炎减轻无关。在RAG?/?小鼠的抗CD40诱导的先天性结肠炎模型中，清除NK细胞和ILC1 IEL可减轻结肠炎但不能减轻全身性炎症。我们在IL-15Rα?/? × TRAG小鼠中未观察到结肠炎减轻，这很可能反映了抗CD40诱导的结肠炎与TRAG结肠炎的不同特征。在RAG?/?小鼠中通过抗CD40给药诱导的结肠炎在无菌条件下不会减轻，并伴有急性全身性炎症。相反，TRAG结肠炎需要微生物，是慢性的，且不包含全身性炎症。这表明ILC1和NK细胞可能对不依赖于微生物的先天性结肠炎很重要，但这些细胞在微生物介导的先天性结肠炎中是可有可无的。
本研究表明，通过γc的信号传导，以及所有ILC亚群的存在，在TRAG小鼠的自发性先天性结肠炎中是冗余的。与TRAG小鼠相比，IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠结肠浸润的非ILC先天性免疫细胞数量没有显著差异。与RAG1?/?或IL-2Rγ?/? × RAG?/?同窝小鼠相比，TRAG和IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的炎症性单核细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞数量均增加。这表明ILC和IL-2Rγ依赖性细胞因子在足以引起结肠炎的先天性免疫细胞的病理扩增中不是必需的。在缺乏适应性免疫和所有ILC的小鼠中，在慢性DSS结肠炎模型中可观察到结肠炎和纤维化。在该模型中，尽管在缺乏ILC时纤维化的诱导没有减弱，但纤维化的恢复受到削弱，表明ILC在炎症后纤维化的消退中发挥作用。我们在TRAG结肠炎模型中未观察到纤维化，因此尚需确定IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中纤维化是否增加。我们还使用IL-2Rγ?/? × RAG1?/?受体在T细胞转移结肠炎模型中观察到了结肠炎，表明在缺乏ILC的情况下结肠炎可能是小鼠IBD模型的一个共同特征。同样，在T细胞转移结肠炎模型中，RAG2?/?与IL-2Rγ?/? × RAG2?/?受体小鼠的结肠炎严重程度相当，表明ILC在T细胞诱导的结肠炎中是可有可无的。此外，正如我们和其他人观察到的，IL-2Rγ?/? × RAG?/?小鼠在SPF条件下不会发生自发性炎症或结肠炎。因此，除了ILC在结肠炎中的冗余作用外，未受挑战的肠道中的稳态不需要适应性免疫或ILC的存在。
TNF是IBD发病机制中的关键细胞因子，抗TNF疗法对IBD和其他炎症性疾病有效。然而，抗TNF疗法在IBD中的作用机制尚不完全清楚。尽管许多细胞类型可以产生TNF，但T细胞或ILC产生的TNF在IBD中的作用尚不清楚。在T细胞转移结肠炎模型中，T细胞产生TNF并非必需，而在SAMP/Yit IBD模型中，T细胞产生TNF起着核心致病作用。ILC1产生TNF，并已被涉及人类IBD发病机制以及T-bet?/? × RAG2?/?（TRUC）先天性结肠炎模型。在接受抗TNF治疗的IBD患者中，ILC1减少而ILC3增加。因此，由ILC产生或作用于ILC的TNF可能在IBD中发挥作用。我们在TRAG和IL-15Rα?/? × TRAG结肠中观察到少量但统计学上显著数量的ILC产生TNF，但在RORγt?/? × TRAG结肠中未观察到，表明ILC可能促进TRAG小鼠中TNF介导的病理。然而，我们的结果表明，ILC和T细胞不是TNF致病性诱导结肠炎所必需的，因为IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠发生需要TNF的结肠炎。TNF由IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠固有层中的髓系细胞产生，我们之前已证明，来自RAG1?/?小鼠的TNF表达造血细胞的骨髓转移足以在TNF?/? × TRAG小鼠中驱动结肠炎。这表明在缺乏ILC的情况下，髓系产生TNF可能驱动结肠炎，但该模型中致病性TNF的来源仍有待阐明。结合抗生素对IL-2Rγ?/? × RAG小鼠结肠炎的预防作用，这些结果与微生物驱动TNF产生并在缺乏适应性免疫和ILC的情况下诱导结肠炎的模型一致。因此，尽管T细胞和ILC是TNF的重要来源，也是抗TNF疗法的靶点，但其他细胞类型产生的TNF也能驱动结肠炎。
结果显示，抗生素治疗IL-2Rγ?/? × RAG小鼠可预防结肠炎，这与细菌在该IBD模型中的作用一致。我们此前观察到肠上皮中TNFAIP3的表达促进微生物侵入内黏液层，特别是γ变形菌门，在IL-10缺乏或缺乏适应性免疫的情况下导致结肠炎。本文提出的结果与这些研究一致，但在IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠中驱动结肠炎的细菌类型仍有待确定。此外，诸如脂多糖（LPS）等单个微生物产物是否足以在该模型中驱动结肠炎尚未确定。
缺乏ILC和适应性免疫是IL-2Rγ?/? × RAG1?/?小鼠的明显特征，但这些小鼠也对多种需要IL-2Rγ发挥功能的细胞因子（IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）缺乏反应性。由于髓系细胞表达IL-2Rγ并受IL-2Rγ依赖性细胞因子调节，髓系细胞IL-2Rγ缺乏可能促进IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎特征。同样，一些IL-2Rγ依赖性细胞因子可以作用于基质细胞。尚需确定髓系和/或基质细胞上缺乏IL-2Rγ是促进还是抑制IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠的结肠炎。最后，必须强调在更广泛解释这些结果时要谨慎。有证据表明ILC在人类免疫防御中具有功能冗余性。本研究表明ILC在TNF驱动的结肠炎发病机制中是冗余的。然而，显然ILC对健康和免疫很重要。缺乏NK细胞的人类表现出病毒感染的增加。目前尚无其他特定的ILC缺陷在人类疾病中被描述，但缺乏单个ILC类型的小鼠在具有功能性适应性免疫的情况下易患结肠炎。ILC与适应性免疫细胞相互作用以指导免疫反应，这一过程的破坏有助于小鼠模型中的IBD。因此，ILC是完整免疫系统的关键组成部分。因此，我们不认为ILC（当然也不认为T细胞）在IBD中是冗余的，而是认为描述缺乏T细胞和ILC时结肠炎的模型将有助于更好地理解IBD的致病机制。例如，在缺乏ILC和T细胞的系统中识别TNF的来源和靶点可能为抗TNF疗法的作用机制提供关键见解，并为IBD的未来治疗指明方向。
研究局限性
这项工作表明ILC不是先天性免疫介导的结肠炎所必需的。我们尚未确定ILC在该模型中对结肠炎保护或加重的个体作用。未来研究使用将单个ILC类型过继转移至IL-2Rγ?/? × TRAG小鼠将有助于阐明ILC亚型特异性在促进或预防结肠炎中的作用。同样，单个ILC类型在T细胞转移结肠炎模型中的作用应在IL-2Rγ?/? × RAG1?/?受体中进行研究。目前的工作集中在结肠炎症，但ILC在其他黏膜表面如肺和皮肤，以及脂肪、神经和其他组织中也发挥关键作用，因此这些部位是否需要ILC仍有待确定。最后，本研究调查了自发性、微生物驱动的结肠炎中对ILC的需求，但ILC在防御病原体和癌症中的需求仍需进一步研究。
资源可用性
主要联系人
如需进一步信息和资源，请联系主要联系人David L. Boone（[e-mail]），他将予以满足。
材料可用性
本研究中生成的所有独特/稳定试剂可从主要联系人处获得，无限制。Villin-TNFAIP3小鼠在完成材料转让协议后可自由获取。
数据与代码可用性
•本文报告的所有数据将在要求时由主要联系人共享。
•本文未报告原始代码。
•重新分析本文报告数据所需的任何其他信息均可向主要联系人索取。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院DK120320-01A1和DK124304A对D.L.B.的资助，并得到印第安纳临床与转化科学研究所的部分支持，该研究所部分由NIH奖号UM1TR004402资助。额外支持由美国胃肠病学基金会试点奖计划提供。我们感谢Kimberly Schluns博士（德克萨斯大学MD安德森癌症中心）提供我们繁育方案中使用的IL-15Rα?/?小鼠。我们感谢圣母大学综合成像设施的Sarah Chapman和Sara Cole，以及哈珀癌症研究所组织库的Emily Cronberger对本研究工作的协助。
作者贡献
概念化，A.T.-H.、K.R.-H.和D.L.B.；方法学，A.T.-H.、K.R.-H.和A.M.R.；调查，A.T.-H.、A.M.R.、L.C.M.、K.R.-H.、M.H.、A.B.-M.、T.R.、M.F.、E.B.、K.E.和A.-C.S.；写作——初稿，A.T.-H.和D.L.B.；写作——审阅和编辑，A.T.-H.、K.R.-H.和D.L.B.；资金获取，D.L.B.；资源，A.B.-M.、K.R.-H.和D.L.B.；监督，D.L.B.
利益声明
作者声明无竞争利益。
关于稿件准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明：本稿件的撰写或准备过程中未使用任何生成式AI或AI辅助技术。
STAR★方法
关键资源表
试剂或资源 来源 标识符
抗体
CD45-AF534 Thermo 货号#58-0451-82；RRID:AB_11218871
CD44-BV570 Biolegend 货号#103037；RRID:AB_10900641
CD11c-BV605 Biolegend 货号#117334；RRID:AB_2562415
CD11b-Spark Blue550 Biolegend 货号#101289；RRID:AB_2922452
Ly6C-BV421 BD 货号#562727；RRID:AB_2737748
Ly6G-BV650 Biolegend 货号#108442；RRID:AB_2686974
F4/80-PeCy5 Thermo 货号#15-4801-80；RRID:AB_468797
CD64-PE Dazzle594 Biolegend 货号#139319；RRID:AB_2566558
KLRG1-PE Fire640 Biolegend 货号#138439；RRID:AB_2936685
NK1.1-BV785 Biolegend 货号#108749；RRID:AB_2564304
Thy1.2-PECy7 Biolegend 货号#140309；RRID:AB_10645336
SiglecF-BV480 BD 货号#746668；RRID:AB_2743940
MHCII-BV750 BD 货号#747458；RRID:AB_2744122
CX3CR1-PE Fire700 Biolegend 货号#149051；RRID:AB_2910299
RORgt-PE BD 货号#562607；RRID:AB_11153137
GATA3-BV711 BD 货号#565449；RRID:AB_2739242
Tbet-PercpCy5.5 Thermo 货号#45-5825-82；RRID:AB_953657
Perforin-FITC Biolegend 货号#154309；RRID:AB_2910315
Viability-eFluor450 Thermo 货号#65-0863-14
Fc Block Biolegend 货号#101302；RRID:AB_312801
化学品、肽和重组蛋白
珀可（Percoll） Cytiva 17089101
RPMI Cytiva SH30011.04
HyClone铁补充小牛血清 Cytiva SH30072.03
EDTA Fisher BP2483500
HBSS 10X Thermo Fisher 14185052
PBS 10X Thermo Fisher 70011044
I型胶原酶 Thermo Fisher 17100-017
脱氧核糖核酸酶I Sigma DN25-1G
小牛血清 Hyclone SH30072.03
青霉素-链霉素 Thermo Fisher 15140163
True-Nuclear?转录因子缓冲液套装 Biolegend 424401
抗大鼠和抗仓鼠补偿微珠 BD 552845
抗小鼠补偿微珠 BD 552843
新霉素 Fisher BP-2669-5
氨苄西林 Fisher BP-1760
实验模型：生物体/品系
Villin-TNFAIP3小鼠 本实验室生成 Kolodziej等
B6 RAG1 KO小鼠 Jackson Labs 品系编号：034159
IL2Rγ-KO小鼠 Jackson Labs 品系编号：033122
RORγt-KO小鼠 Jackson Labs 品系编号：007571
IL15Rα?KO小鼠 由K. Schluns博士赠送 Lodolce等
TNF-KO小鼠 Jackson Labs 品系编号：005540
软件和算法
FlowJo BD Biosciences 版本10.9
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实验模型和研究参与者细节
动物实验方案经圣母大学机构动物护理和使用委员会批准（方案号23-03-7746和23-06-7950）。所有小鼠均在C57BL/6背景上繁殖和维持，饲养在环境控制的SPF条件下，光照周期为12小时，并提供充足的食物和水。Villin-TNFAIP3品系先前通过villin基因座的BAC重组工程生成，并如所述进行表征。RAG1-/-、TNF-/-、RORC-/-和IL2Rγ-/-小鼠（C57Bl/6）购自Jackson实验室。IL15Rα-/-小鼠由Kimberly Schluns博士（UT MD Anderson癌症中心）赠送。这些小鼠与villin-TNFAIP3小鼠杂交，生成villin-TNFAIP3 × RAG1-/-（TRAG）小鼠、IL15Rα-/- x TRAG、IL2Rγ-/- x TRAG、TNF-/- x IL2Rγ-/- x TRAG小鼠或同窝对照。无论基因型如何，所有小鼠均与最多4只同窝对照共同饲养（每笼共5只小鼠），因为该模型中的结肠炎不可传播。对雄性和雌性小鼠进行了研究，雄性和雌性小鼠中观察到相似程度的结肠炎（图S3）。小鼠在8周龄时评估结肠炎。
方法细节
结肠炎的组织学评估
从8周龄小鼠收集组织，用福尔马林固定，FFPE样品用苏木精和伊红（H&E）染色。玻片由三名或更多盲法评审员对结肠炎体征进行评分，如先前所述。简要来说，切片对8个标准（炎症浸润、杯状细胞丢失、隐窝密度、隐窝增生、肌肉厚度、黏膜下浸润、隐窝脓肿和溃疡）从0-3评分，并在各评审员之间取平均，得出0到24分的评分。
固有层淋巴细胞分离和分析
通过酶消化和密度梯度离心从肠道组织中分离LPL，如先前所述。简要来说，切除带有盲肠（去除盲肠淋巴斑）的结肠或小肠（排除派尔集合淋巴结），清洁并切碎，然后在CMF（无钙镁PBS含2%小牛血清）中洗涤3-5次。通过在CMF + EDTA（2mM）中摇动（37°C，20分钟）去除肠上皮细胞。然后组织块在消化缓冲液（RPMI + 100U/ml胶原酶 +10U/ml DNase）中摇动（37°C，60分钟），并通过70uM滤网收集解离细胞。细胞随后通过40% Percoll离心（600g，20分钟）富集白细胞。分离的LPL随后对表面标记和细胞内蛋白进行染色，并使用光谱细胞仪（CYTEK）和FlowJo软件分析。LPL类型的设门策略在补充数据中提供（图S4），每种细胞类型的关键标记在表S1中描述。
抗生素处理
4周龄小鼠在饮用水中给予抗生素（0.5g/L氨苄西林 + 0.25g/L新霉素）持续4周。该方法足以在该先天IBD模型中清除微生物并预防结肠炎。在8周龄时，收集组织用于组织学和LPL定量，如上所述。
T细胞转移性结肠炎
收集供体小鼠脾脏，解离成单细胞悬液，通过磁珠去除法（MoJo Sort CD4富集试剂盒（货号#480005））富集CD4细胞，然后进行FACS分选（BD FacsAria）收集初始CD4+ CD45Rbhi T细胞。将分选细胞（或盐水对照）注射到受体IL2Rγ-/- x RAG1-/-小鼠中（50,000/小鼠，腹腔注射），并在T细胞转移后6周收集组织用于组织学。
LPL的TNF细胞内染色
如稿件STAR方法部分所述收集LPL，悬浮于RPMI中，在布雷菲德菌素A存在下用PMA（25ng/ml）和离子霉素（500ng/ml）刺激4小时，然后如稿件所述进行表面和细胞内染色，加入FITC抗TNF（Biolegend，货号#506304），随后如稿件所述进行收集、分析和细胞计数。
定量和统计分析
所有实验使用至少3只，最多9只个体小鼠，所有图中的每个数据点代表一只小鼠的结果。条形图表示每组的平均值±SEM。组织学评分数据通过单因素ANOVA结合事后非参数检验（Kruskal-Wallis和Dunn多重比较）分析，LPL数据通过ANOVA结合事后Tukey检验分析，p值小于0.05视为统计学显著。统计细节见每个图例。
补充信息 (1)
PDF (4.88 MB)
文件S1。图S1–S7和表S1