源于Vitis amurensis的Pseudomonas marginalis RA62c-B2多机制促生特性及全基因组解析

《Horticulturae》：Plant Growth-Promoting Activity and Whole-Genome Analysis of Pseudomonas marginalis RA62c-B2 Isolated from Vitis amurensis

　　

假单胞菌属（Pseudomonas）细菌作为有效的植物促生菌，通过从植物激素合成到养分活化及植物病原菌抑制等一系列复杂生理机制发挥其潜力。这些特性使Pseudomonas菌株成为可持续农业中开发环境友好型生物制剂的候选者。本研究对从山葡萄（Vitis amurensis）中分离的Pseudomonas marginalis RA62c-B2菌株进行了综合表征，将全基因组分析与实验室及植物实验验证相结合。P. marginalis RA62c-B2基因组大小为6,620,267 bp，编码6545个蛋白编码序列。基因组分析揭示了一系列支持植物促生的功能基因，包括参与吲哚-3-乙酸（IAA）和细胞分裂素生物合成、有机酸产生、氮代谢、磷和钾活化、铁同化、硫代谢、渗透和氧化胁迫抗性以及生物修复潜力的基因。结合基因组数据，HPLC-MS代谢物谱分析为该菌株生物合成途径提供了功能验证：在P. marginalis RA62c-B2培养物提取物中鉴定到色氨酸代谢物（吲哚-3-乙醛和吲哚-3-甲醛），以及两种细胞分裂素（反式玉米素和N⁶-异戊烯基腺嘌呤）。此外，用P. marginalis RA62c-B2单次接种水稻种子显著提高了幼苗和30日龄植株的生长参数。这些表型效应与该菌株的遗传特征一致，反映了其通过多种互补机制促进植物生长的多重能力。

研究背景与目的：全球粮食安全和环境可持续性要求以生态友好方式提高作物产量。基于植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）的微生物生物刺激剂可在减少合成投入的同时提升植物表现。PGPB的关键促生基因通常涉及植物激素生物合成、养分有效性提升和植物胁迫缓解等类别。Pseudomonas属因作用机制多样且与多种作物兼容而受到广泛研究，但新菌株的发现及其促生潜力和分子机制仍未完全表征。Vitis amurensis Rupr.为亚洲原生野生葡萄，常生长于高海拔严酷环境，具有耐低温及对炭疽病、白腐病、白粉病等抗性，其内生微生物组可能蕴含兼具胁迫适应性和促生能力的菌株。为此，研究人员从V. amurensis无症状叶片分离内生菌株RA62c-B2，采用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）、专用培养基、靶向生化测定和植物生物测定，综合表征其植物促生性状。

关键技术方法与样本来源概述：菌株分离自Vitis amurensis无症状叶片；以Ashby、Pikovskaya、Alexandrovsky和改良Thiosulfate Agar进行氮获取、溶磷、溶钾和硫氧化表型检测；采用HPLC-MS/HPLC-DAD分析植物激素及色氨酸代谢物；对菌株进行Illumina MiSeq全基因组测序，SPAdes组装、BUSCO评估，bakta和eggNOG-mapper注释，PGPT-Pred PlaBase预测促生基因，antiSMASH预测次级代谢基因簇；以OrthoVenn3、ANI和dDDH进行比较基因组与系统发育鉴定，PCR验证部分注释基因；并以水稻品种Oryza sativa ‘Dubrava’进行种子接种的皿和盆栽生物测定。

研究结果：3.1 与PGPB功能相关的可观察表型性状：通过固体培养基表型和HPLC-MS分析，菌株呈杆状、革兰阴性、具荚膜和鞭毛，尺寸为1.57 ± 0.1 μm；在Ashby培养基生长提示氮获取，在Pikovskaya和Alexandrovsky培养基形成透明晕圈提示溶解无机磷和钾，在TSA形成黄色晕圈提示硫氧化；培养物提取物中检测到吲哚-3-乙醛、吲哚-3-甲醛、反式玉米素和N⁶-异戊烯基腺嘌呤。3.2 P. marginalis RA62c-B2接种对Oryza sativa生物量参数和干生物量的影响：该菌株对Alternaria alternata、Erwinia billingiae和Fusarium avenaceum未表现拮抗；水稻种子接种后，7日龄幼苗胚芽鞘长度较对照降低11.5%，根长增加10%，幼苗干重增加17.4%；30日龄植株茎长增加24.5%，根长增加24.13%，茎干重增加44.2%，根干重增加63.8%。3.3 系统发育鉴定：基于基因组序列的ANI和dDDH分析显示，RA62c-B2与Pseudomonas marginalis ICMP3553最相似，ANI为98.3%，dDDH为85.4%，结合系统发育树将其鉴定为P. marginalis。3.4 基因组特征与比较遗传分析：基因组为6,620,267 bp，组装为81个scaffold，平均GC含量60.6%，编码6545个蛋白编码序列、61个tRNA基因、9个rRNA基因和3个前噬菌体编码位点，完整度100%，污染度0.43%；基因本体（GO）分类注释5471个基因，KEGG（京都基因与基因组百科全书）分类注释5957个基因并分为256类，COG（直系同源簇）注释6401个基因；4株Pseudomonas比较显示共有4133个蛋白簇，RA62c-B2与P. lurida LMG 21995共享簇最多（4908个），并有10个独有蛋白簇；antiSMASH分析发现11个次级代谢基因簇，arylpolyene、beta-lactone、NRPS、NAGGN和redox cofactor生物合成簇在比较菌株中保守，RA62c-B2、M13、PS92和Qb1D2中检测到氢氰酸，RA62c-B2和Qb1D2中鉴定到viscosin和histicorrugatin，icosaside A生物合成基因簇为RA62c-B2独有，viscosin和histicorrugatin生物合成基因序列相似性分别为100%和94%。3.5 P. marginalis RA62c-B2与植物促生相关基因：PGPT-Pred PlaBase分析显示，31%的促生基因与直接机制相关，包括10%激素合成、13%养分生物有效性提升和8%生物修复；69%与间接机制相关，包括26%植物系统定殖、20%生物和非生物胁迫控制、22%竞争排除和1%植物免疫应答刺激；基因组含IAM途径IAA生物合成基因iaaM和iaaH、细胞分裂素生物合成相关基因BacCYPs、miaAB、fni和ispDEFU，以及磷、钾、硫、铁、氮利用相关基因和葡萄糖酸、富马酸、琥珀酸等有机酸合成基因；还含渗透胁迫（betABIT、opuAA、opuAB、prop）和氧化胁迫（katBE、sodB、ahpCF、msrAB、gshAB）相关基因、二甲苯降解基因（xylABFGHR）和儿茶酚途径基因（pcaGHBKRF）；PCR验证了phoU、katB、cysA、miaB和opuA等注释基因。

讨论与结论：讨论指出，RA62c-B2的基因组潜力与实验确认的促生活性总体一致。Ashby培养基生长提示氮获取，但未检出固氮基因，可能由替代利用途径或协同因子支持；溶磷、溶钾与转运基因及有机酸合成基因一致；硫氧化与硫代谢基因一致。IAA生物合成IAM通路基因iaaM和iaaH存在，但HPLC-MS未检出IAA，可能因实验室条件下未表达，色氨酸衍生物提示IAA合成可能受色氨酸底物可用性限制。成熟细胞分裂素及支持其合成的基因集提示该菌株可产生多类型细胞分裂素，可能促进根系发育和生物量积累，其防御作用仍需研究。水稻接种表型与激素产生、养分活化和有机酸合成的综合作用一致；PGPT-Pred显示31%直接和69%间接促生基因，体现多功能性。viscosin和histicorrugatin基因簇存在但体外无拮抗，提示竞争排除、定殖、免疫调节及生物膜相关生态功能。渗透/氧化胁迫和生物修复相关基因进一步提示其多面性，但各机制对总体促生效应的具体贡献需进一步研究。

结论部分翻译：本研究表征了从Vitis amurensis分离的RA62c-B2菌株，通过系统发育分析确认其为Pseudomonas marginalis。该菌株表现出多种植物促生性状：合成反式玉米素和N⁶-异戊烯基腺嘌呤等成熟植物激素，增强关键养分（P和K）的生物有效性，并携带支持胁迫耐受和生物修复（如二甲苯降解、儿茶酚途径）的基因。实验数据表明，单次施用RA62c-B2悬液显著刺激O. sativa生长，但其潜在机制需进一步阐明。需要指出，这些结果是在单一处理的受控条件下获得，应避免直接外推至田间表现。这些发现为开发基于该菌株的生物制剂奠定基础；未来工作将聚焦评估其在产业化葡萄园中对葡萄生长和果实品质的影响。