生物分子凝聚体的邻近标记方法及其解读

《Current Issues in Molecular Biology》：Proximity Labeling of Biomolecular Condensates: Methods and Interpretation

　　

生物分子凝聚体是具有动态性和组成异质性的组装体，可组织转录、RNA代谢、应激适应和蛋白质稳态。其弱相互作用和快速的分子交换使得传统分离方法容易丢失空间背景信息。邻近标记（PL）能够在裂解前对靶向酶或光催化剂周围的分子进行共价记录，但回收的信号取决于化学性质、标记持续时间、分子丰度、可及性以及致密相与稀相的分配。本叙述性综述提供了一个以凝聚体为中心的框架，用于方法选择和结果解读。研究人员比较了过氧化物酶、生物素连接酶和光催化策略，包括定量参数以及直接RNA标记、蛋白质谱分析和全动物应用之间的区别。综述涵盖了对应激颗粒、肉瘤融合蛋白（FUS）和TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）组装体、转录凝聚体、多相生殖颗粒以及核区室的应用，揭示了条件依赖性的组成变化。一项跨研究的蛋白质与RNA图谱比较凸显了诱饵选择、应激、采样时间和化学性质的影响。研究人员还讨论了接触捕获和定向运输作为互补测量手段。底物分配、残基偏好、诱饵融合效应、反应诱导的应激以及富集背景均需明确的对照。由于邻近本身并不能建立直接结合、液-液相分离（LLPS）、稳定驻留或因果关系，因此需要定量成像、合适的模型和功能验证来将候选列表与机制联系起来。

1. 引言

细胞通过有膜细胞器和无膜浓缩组装体来组织生化反应。核仁、应激颗粒（SGs）、转录凝聚体及相关结构能够浓缩蛋白质和核酸，同时与其周围环境进行物质交换。液-液相分离（LLPS）为许多此类组装体提供了物理框架，但一个浓缩的点状结构本身并不足以证明LLPS是其潜在机制。更广泛的术语“生物分子凝聚体”涵盖了具有不同分子来源和物质状态的组装体，必须通过实验加以区分。凝聚体的组成是动态的，并可能随细胞状态、应激、疾病相关突变及翻译后修饰而变化。对肉瘤融合蛋白（FUS）和TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的研究已将此类变化与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）中改变的蛋白质稳态联系起来。在癌细胞中，转录凝聚体也可能参与免疫检查点基因的调控。此外，FTH1的相分离已在铁死亡的背景下得到研究。因此，理解功能不仅需要识别组装体附近的分子，还需要确定它们何时被招募、是否分配到致密相以及是否在机制上对组装或细胞输出有所贡献。分析挑战始于样品制备。裂解、稀释和洗涤会改变相平衡并移除弱或瞬时的关联。免疫共沉淀可以回收稳定的复合物，但可能丢失凝聚体的空间背景。邻近标记（PL）通过在裂解前将酶或光催化剂定位到目标附近，产生与相邻分子共价标记的反应性中间体，从而解决这一限制，之后标记材料可被富集用于质谱（MS）或测序。一般的PL综述描述了潜在的化学原理、实验设计以及在亚细胞蛋白质组学中的应用。本综述聚焦于凝聚体，其中致密相与稀相之间的交换、高局部浓度和异质性组成造成了独特的解读难题。本综述区分了标记获得的空间信息与解释凝聚体行为所需的证据。标记记录了实验窗口内的化学可达性；直接结合、稳定驻留、LLPS和功能性因果关系需要额外证据。我们比较了每种化学方法测量的内容，并探讨了匹配的对照和正交测定如何支持解读。本次修订中，于2026年10月17日使用PL方法名称结合生物分子凝聚体、相分离和应激颗粒等术语，对PubMed和出版商网站进行了针对性检索，随后进行了参考文献核查。优先纳入介绍了相关化学方法或直接研究了凝聚体相关分子的原创研究。保留了少量背景研究以讨论候选分子的多功能性或仿生应用。预印本已明确标注。这是一篇叙述性综述；筛选并非旨在成为详尽的系统性检索。

2. 解读生物分子凝聚体中的邻近标记

2.1 邻近性是空间和时间整合的记录

邻近标记应被解读为在反应窗口内可从催化剂化学接近的分子的记录。富集可能源于高局部浓度、重复瞬时接触、缓慢交换、有利的反应位点可及性或更高的丰度。凝聚体带来了进一步的复杂性，因为相同的诱饵可能同时占据致密相和稀相，并在应激后重新分布。对工程化抗坏血酸过氧化物酶变体APEX2和TurboID在匹配亚细胞背景下的直接比较发现，这两种酶回收了重叠但不完全相同的蛋白质组，表明催化剂化学性质和反应条件会影响回收的图谱。这一问题对于组成随时间变化的凝聚体尤为重要。近期工作强调，具有相同操作名称的组装体在不同刺激和细胞状态下可能表现出显著的组成异质性。因此，PL数据集最好被视为特定条件下的邻域图。不同条件之间的差异可能提供高度信息，但不应自动转化为结合亲和力、分配系数或物质状态的差异。

2.2 凝聚体特异性混淆因素

催化剂定位并不能保证底物的均匀可用性。实验表明，小分子可以选择性地分配到核凝聚体中。因此，生物素、生物素-苯酚、光敏剂或捕获探针可能在致密相和稀相中具有不同的可用性，但其分配必须在相关系统中测量，而不能仅从药物分配推断。拥挤可能减慢扩散，而局部清除剂、竞争性反应和溶剂可及性的变化可能缩短或重新分布活性物种的捕获。这些效应可能相互抵消；更致密的相不一定产生更大或更小的有效标记半径。反应位点的可用性进一步影响回收率。位点分辨测量支持APEX优先标记酪氨酸，而BioID家族连接酶优先标记赖氨酸。因此，富含赖氨酸的低复杂度区域即使母体蛋白局部富集，也可能被连接酶取样不足。蛋白质其他位置的可及位点、翻译后修饰、分子丰度和停留时间也很重要。因此，未检测到的信号并不证明某分子被排除在凝聚体外，不同化学方法之间的差异也不应被视为结合亲和力的变化。诱饵融合本身可能会改变系统。标签身份、位置、连接子设计、催化活性和表达水平应针对内源性或未标记的表型进行测试。荧光和肽标签的实验比较显示了蛋白质依赖性的凝聚和动力学变化；这促使需要对PL融合进行验证，但并不表明特定的PL酶必然引起相同效应。内源性标记降低了过表达相关的风险，但不能消除融合效应。过氧化物和光照对照必须额外区分预期的组装扰动与标记反应引起的扰动。

2.3 对照与正交验证

对照应围绕主张进行设计。自由分布的催化剂估计可及的背景；定位匹配的对照有助于区分区室富集与诱饵特异性邻近；无底物、无光照或无过氧化物对照测试反应依赖性；组装缺陷突变体仅在表达、定位和催化剂活性保持可比时才具有信息量。时间匹配的对照尤为重要，因为扰动本身可能导致诱饵重新分布或改变区室可及性。随后，正交验证应解决感兴趣的机制层面。显微镜可以测试定位和共定位；定量致密相与稀相分配和浓度依赖性可以测试选择性富集；荧光恢复和相关测量可以探测交换；体外重构可以评估内在组装行为；使用纯化组分进行的结合测定、位点分辨交联或结构分析可以测试直接的分子接触。确立LLPS需要超越圆形斑点或邻近富集的证据，功能结论需要扰动并在可能的情况下进行拯救。基于图像的分割通过定义光学可分辨的边界并量化大小、伸长率和形状随时间的变化来补充PL。在ZO-1紧密连接组装中，时间分辨APEX2蛋白质组学与分割活细胞成像相结合，将邻域重塑与凝聚体延伸和偏心率联系起来。Cellpose分割细胞边界，而Fiji单独用于ZO-1信号。Punctatools提供了另一个面向凝聚体的图像分析示例。分割掩模应在不同条件下进行检查，并报告图像分辨率、背景校正和边界不确定性。这些测量描述了凝聚体形态；它们不能从PL列表中重建蛋白质复合物的分子形状。

2.4 定量参数与空间解读

表1比较了代表性实施方式，而非在标准化条件下对平台进行排名。催化剂质量不包括诱饵和可选报告基因。反应窗口不包括表达、探针加载、洗涤、富集和分析。短脉冲后的可检测标记并不保证足以用于发现性蛋白质组学的覆盖度。RNA能力和完整动物标记是独立的终点；在培养的活细胞中成功标记并不能自动证明两者中的任何一个。报道的标记距离也描述了不同的量。分子尺子估计值、计算的反应性中间体扩散距离和表观荧光簇宽度不可互换。例如，超分辨率校准报告了抗体靶向μMap和辣根过氧化物酶在牛血清白蛋白包被盖玻片上的横向半峰全宽分别为54 ± 12 nm和269 ± 41 nm；靶向系链和读出方式导致了这些表观宽度。这些测量不是在凝聚体内进行的，不应简单地除以二来转换为化学半径。相关比较是在经过验证的标记足迹和独立测量的凝聚体尺寸之间进行的。作为一个说明性的几何例子，名义上20 nm的覆盖范围是一个半径为0.5 μm的凝聚体半径的4%。单个固定催化剂只能取样局部区域，而分布在致密相中的催化剂可以共同标记更大的体积。靠近边界的催化剂可以标记其外部的可及邻居。脉冲期间催化剂的运动和分子交换进一步将回收的邻域与清晰界定的快照区分开来。因此，凝聚体尺寸、探针分配和空间对照必须伴随任何基于半径的解读。