转移性胃癌长期生存的分子决定因素探索：一项mRNA表达初步研究

《Current Issues in Molecular Biology》：Exploring Molecular Determinants of Long-Term Survival in Metastatic Gastric Cancer: An mRNA Expression Pilot Study

　　

摘要专业翻译 转移性胃癌（metastatic gastric cancer, mGC）患者的预后仍然较差，总生存期（overall survival, OS）存在显著的患者间差异。研究人员分析了35例mGC患者的肿瘤组织，将其分为长期生存者（n = 4）、中期生存者（n = 12）和短期生存者（n = 19）。在探索性、假设生成的框架下，采用NanoString技术对Wnt/β-catenin相关基因进行了mRNA表达谱分析。热图分析揭示了三个表达聚类。聚类1显著富集了CDH1、SRC和WNT5A。聚类2显著富集了MMP2、ZEB1、MMP2、TIPE3和RXRG，与更具侵袭性的表型一致。聚类3初步识别出一种探索性分子模式，需要在更大的独立队列中进行验证。

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一、研究背景与问题

转移性胃癌（metastatic gastric cancer, mGC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管在欧洲，胃癌的5年生存率约为25%，但mGC患者的预后仍然很差，中位总生存期（overall survival, OS）约为8至13个月。过去十年间，系统性治疗的进展改善了临床结局，促使一部分患者实现了长期生存。这一进展主要得益于生物标志物指导的治疗策略。目前，mGC中已确立的四种分子生物标志物包括人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）、程序性死亡配体1（programmed death ligand 1, PD-L1）、密蛋白18.2（claudin 18.2, CLDN18.2）和微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）。CheckMate 649试验的长期生存数据显示，接受纳武利尤单抗联合化疗的PD-L1 CPS≥5患者中，5年生存率达16%，而单纯化疗组仅为6%。然而，迄今尚无特定生物标志物能够精确分层mGC患者并预测长期生存。

尽管取得了这些进展，临床结局仍存在显著异质性。虽然MSI-high和EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV）阳性肿瘤在某些临床背景下与良好结局相关，但弥漫型组织学、CDH1改变、腹膜播散以及上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）相关特征持续提示较差的预后。TCGA和ACRG等分子分型系统揭示了胃癌的显著多样性。其中，Wnt信号通路失调在胃癌的发生发展中发挥重要作用，据报道高达50%的胃癌病例存在Wnt通路失调。WNT5A作为非经典Wnt信号的主要介质，与胃癌的侵袭性和淋巴结转移相关。此外，Wnt与维甲酸受体（retinoic acid receptor, RAR）通路之间存在功能性相互作用，但各RAR亚型的生物学效应具有背景依赖性。RARγ（RARG）已被报道可结合β-catenin并促进其核积累及下游Wnt/β-catenin信号传导，其高表达与较差的总体生存率和EMT相关表型相关。

鉴于精准肿瘤学时代长期生存者数量的增加，探索超常生存的生物学决定因素日益重要。本研究旨在探索特定基因表达谱——特别是与Wnt信号、维甲酸受体通路和EMT相关过程相关的表达谱——是否与mGC患者的长期生存相关。

二、研究内容与结论

研究人员对35例接受化疗的mGC患者进行了分析，其中4例患者接受雷莫西尤单抗治疗，8例HER2阳性肿瘤患者接受曲妥珠单抗治疗。患者根据从mGC一线治疗开始计算的OS被描述性地分为长期生存者（n = 4）、中期生存者（n = 12）和短期生存者（n = 19）。中位OS为8个月，范围约为4个月至7年以上。

通过无监督基因表达分析，研究人员识别出三个探索性分子聚类。聚类1（n = 27）显著富集了CDH1、SRC、WNT5A和HER2，与上皮/受体富集的分子谱一致。聚类2（n = 5）显著富集了MMP2、ZEB1、SNAI1、TWIST、CDKN1A、RXRG、EBER1、TIPE3、VCL和EGFR，该模式与EMT/侵袭富集信号相符。聚类3（n = 3）中WNT2、TWIST1、SNAI1和WNT7A显示名义p值<0.05，但FDR校正后均不显著。值得注意的是，所有4例长期生存者均分布于聚类1，但该聚类也包括了23例非长期生存者，Fisher精确检验不显著（p = 0.553），表明聚类1成员身份与长期生存无统计学关联。

研究结果表明，观察到的分子聚类主要反映转录异质性而非不同的预后类别。然而，不同生物学程序的识别可能为进一步研究潜在与临床结局相关的分子特征提供基础。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）肿瘤标本的RNA提取，使用RNeasy DSP FFPE试剂盒；采用定制设计的NanoString探针面板（NanoString Technologies）进行mRNA表达谱分析，该面板最初包含40个基于生物学相关性预先选择的基因，涵盖Wnt信号通路及其相互作用网络（包括RAR/RXR和EMT信号）；使用nSolver软件4.0版进行数据处理和标准化；基于方差过滤排除低信息量基因后，对保留的30个基因进行z-score标准化和主成分分析（principal component analysis, PCA）；采用平均轮廓宽度、gap统计量和共识聚类（1000次重采样迭代）评估聚类数目，最终选择k = 3解决方案；采用one-versus-rest方法结合Mann–Whitney–Wilcoxon检验和Benjamini-Hochberg多重比较校正识别各聚类富集基因。样本队列来源于mGC患者的诊断性核心活检和手术胃切除标本。

四、研究结果

4.1 临床与人口学特征

共纳入35例转移性疾病患者。所有患者均接受化疗；4例在新辅助治疗6个月内复发的患者额外接受抗血管生成抗体雷莫西尤单抗，8例HER2阳性肿瘤患者接受曲妥珠单抗。患者被描述性地分为长期生存者（n = 4）、中期生存者（n = 12）和短期生存者（n = 19）。中位总生存期为8个月，范围为4个月至7年以上。

4.2 主成分分析与热图结果

在最初纳入的40个基因中，10个因低表达变异性（零方差或方差低于第一四分位数）被排除，剩余30个基因经z-score标准化后保留用于PCA和聚类分析。通过平均轮廓宽度、gap统计量和模糊聚类比例探索k = 2至k = 6的聚类数目。三聚类解决方案具有最高的平均轮廓宽度（0.261），因此被选为简约且生物学上可解释的方案。PCA图显示三个聚类的患者清晰分离，PC1和PC2分别解释了总方差的23.3%和19.5%，合计42.8%。热图显示长期生存者均分布于聚类1，但该聚类也包含短期生存者；HER2阳性肿瘤似乎优先分布于聚类3。

4.3 分子特征

差异基因表达分析进一步表征了三个共识聚类。聚类1（n = 27）与其余样本相比，CDH1、SRC、WNT5A和HER2的相对表达显著升高（Benjamini-Hochberg FDR校正<0.05），与上皮/受体富集的分子谱一致。聚类2（n = 5）显著富集MMP2、ZEB1、SNAI1、TWIST、CDKN1A、RXRG、EBER1、TIPE3、VCL和EGFR（FDR<0.05），该模式与EMT/侵袭富集信号相符。聚类3（n = 3）中WNT2、TWIST1、SNAI1和WNT7A显示名义p值<0.05，但FDR校正后均不显著。腹膜受累在聚类1、2和3中分别占44.4%、60.0%和33.3%。在长期生存者中，3例（75%）无腹膜受累。组织学分类方面，35例肿瘤中14例（40.0%）为Lauren弥漫型，其中聚类1有11例，聚类2有3例。组织学亚型与分子聚类之间无显著关联（p = 0.145）。

五、讨论与结论

聚类1以参与上皮分化、细胞黏附和受体相关信号传导的基因表达升高为特征，包括CDH1、SRC、CTNND1、ERBB2和WNT5A。长期生存者在该聚类中的优势分布提示，上皮结构和细胞间黏附的保留可能与侵袭性较低的肿瘤表型相关，但该聚类不应被解释为有利生存的信号。CDH1编码E-cadherin，是黏附连接和上皮完整性的核心组分。然而，WNT5A的伴随富集表明聚类1不能被视为统一有利的分子表型。

聚类2显著富集EMT调节因子（ZEB1、SNAI1和TWIST1）以及参与侵袭和细胞外重塑的基因（MMP2、CDKN1A、RXRG、EBER1、TNFAIP8L3/TIPE3、VCL和EGFR）。该表达模式与ACRG分子分型中描述的EMT相关亚型具有生物学共性，与生物学侵袭性表型一致。RXRG的富集值得关注，考虑到维甲酸受体信号、Wnt激活和EMT相关过程之间的已知联系。

聚类3以HER2阳性肿瘤为主，显示参与受体酪氨酸激酶信号传导的表达模式。然而，该聚类仅含3个样本，且无基因在FDR校正后保持显著，因此无法对该聚类进行可靠的生物学表征。

Wnt、维甲酸受体和EMT信号之间的复杂相互作用可能影响肿瘤侵袭性和治疗敏感性。异常Wnt信号与胃癌抗癌治疗耐药相关，β-catenin激活与顺铂耐药获得相关。相反，维甲酸信号据报道可调节对细胞毒性药物的敏感性。然而，这些机制在本研究中未被直接研究，应视为生物学假设而非观察到的生存差异的解释。

本研究的主要局限性包括：样本量小且为初步研究性质；大多数患者在免疫检查点抑制剂和CLDN18.2靶向治疗广泛采用之前接受治疗；并非所有病例均具备全面的生物标志物信息（特别是PD-L1和CLDN18.2）。总体而言，研究结果未证明mGC长期生存可由特定分子特征解释。尽管所有长期生存者均出现在聚类1中，但该关联不具有统计学显著性，且大多数聚类1患者并非长期生存者。最强的基因水平发现描述了聚类间的探索性转录差异，特别是上皮/黏附相关、EMT相关和HER2相关的转录程序。这些观察表明，转录异质性超出了当前已确立的生物标志物，可能有助于mGC临床结局的多样性。需要在更大的当代队列中进行验证，整合转录组和生物标志物数据，以确定其预后意义和潜在治疗意义。