共表达ALDH1和ADH1的腺病毒载体可减轻酒精毒性，并调节葡萄糖和脂质代谢

《iScience》：Adenoviral vector co-expressing ALDH1 and ADH1 mitigates alcohol toxicity and modulates glucose and lipid metabolism

　　**亮点**
• C68-ALDH1-ADH1 在体内增强乙醇和乙醛的代谢
• ALDH1 和 ADH1 的共过表达重新编程了肝脏的代谢途径
• FAR2 协调脂肪醇代谢与 ALDH1 和 ADH1 介导的解毒作用
• C68-ALDH1-ADH1 减轻了酒精和高脂肪饮食引起的肝脏损伤

**摘要**
过量饮酒仍然是全球健康的担忧，乙醇及其有毒代谢物乙醛会造成显著的生理伤害。目前的解酒方法未能在根本上提高酒精代谢能力。在这项研究中，我们构建了一种重组腺病毒——过氧化氢酶 68-乙醛脱氢酶 1-乙醇脱氢酶 1（C68-ALDH1-ADH1），它同时表达脱氢酶 ALDH1 和 ADH1 以提高酒精代谢能力。体外和体内实验表明，C68-ALDH1-ADH1 显著降低了肝脏中的乙醇和乙醛水平，并减轻了肝脏损伤。ALDH1 和 ADH1 的过表达还改善了葡萄糖和脂质代谢。值得注意的是，与脂质代谢相关的基因脂肪酰辅酶 A 还原酶 2（FAR2）与 ALDH1/ADH1 的表达相关，这将其与酒精解毒和脂肪醇循环联系起来。C68-ALDH1-ADH1 通过这一途径进一步改善了非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。这些发现支持 C68-ALDH1-ADH1 在治疗酒精相关疾病中的潜在保护作用。

**引言**
过量饮酒与多种不良的身体和心理健康问题相关。它显著增加了焦虑和精神障碍的风险，并占全球疾病负担的约 4.7%，包括酒精相关性肝病（ALDs）和心血管疾病。酒精摄入与疾病之间的强烈相关性可能是由于代谢途径的紊乱所致。只有少量的乙醇在尿液排出前经历生物转化，大约 0.6%–1.5% 通过葡萄糖醛酸化形成乙基葡萄糖醛酸酯，0.1% 通过硫酸化形成乙基硫酸盐。这些过程主要发生在肝脏中，给器官带来巨大的代谢压力。

酒精代谢包括两个主要步骤：将乙醇转化为乙醛，然后将乙醛氧化为乙酸。这两个步骤主要发生在肝脏中。第一步由位于细胞质中的乙醇脱氢酶（ADH）催化，该酶将乙醇转化为乙醛同时将 NAD+ 还原为 NADH。在各种亚型中，I 类 ADH（ADH1）占总乙醇氧化能力的约 70%。此外，位于内质网（ER）和线粒体中的细胞色素 P450 2E1（CYP2E1）也参与酒精代谢，对重度饮酒者尤为重要。此外，过氧化物酶体中的过氧化氢酶在乙醇代谢中表现出独特的催化活性。乙醛脱氢酶（ALDH）是负责将乙醛转化为乙酸的主要酶，无论是细胞质中的 ALDH1 还是线粒体中的 ALDH2 都将乙醛代谢为毒性较低的乙酸。乙酰辅酶 A 合成酶随后将乙酸转化为乙酰辅酶 A，后者进入三羧酸循环或作为脂肪酸（FA）合成的底物。

酒精代谢会产生多种有毒副产物，尤其是乙醇和乙醛，它们通过抑制肝细胞中的电压依赖性阴离子通道来损害线粒体的 β-氧化。根据欧盟法规（欧洲共同体 [EC] 1272/2008），乙醛作为第 2 类致癌物，其积累与上消化道鳞状细胞癌的风险增加密切相关。酒精及其代谢物乙醛通过多种机制破坏脂质代谢，导致 NADH/NAD+ 比例失衡，从而抑制线粒体的 β-氧化和肝脏甘油三酯的积累。此外，酒精促进棕榈酸掺入甘油三酯并增强外源性 FA 的吸收。这些效应共同凸显了酒精对 FA 代谢途径的负面影响。

**研究方法**
我们使用具有广泛组织嗜性和高效基因转移能力的黑猩猩腺病毒载体 AdC68 构建了过氧化氢酶 68-ALDH1-ADH1（C68-ALDH1-ADH1）。ALDH1 基因被置于肝脏特异性启动子 TBG 的控制下并克隆到 AdC68 载体的 E1 缺失区域，而由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的 ADH1 被整合到同一载体的 E3 缺失区域。我们进一步研究了酒精摄入、糖代谢和脂肪醇相关脂质代谢之间的相互作用。结果表明，C68-ALDH1-ADH1 有效加速了酒精代谢，并显示出在治疗酒精相关疾病中的潜在保护作用。

**结果**
**体外实验**
先前的研究表明，乙醇在 NAD+ 存在下被 ADH 氧化为乙醛，随后乙醛在 NAD+ 的存在下被 ALDH 转化为乙酸（图 1A）。基于这一明确的代谢途径，我们使用黑猩猩腺病毒载体 AdC68 构建了重组腺病毒。ALDH1 基因在 E1 缺失区域插入，而由 CMV 启动子驱动的 ADH1 基因被克隆到 E3 缺失区域（图 1B）。

**体内实验**
C68-ALDH1-ADH1 在体内有效加速了乙醇代谢，并显示出在治疗酒精相关疾病中的潜在保护作用。

**结论**
C68-ALDH1-ADH1 通过重新编程肝脏代谢途径和增强解毒能力，有效减少了乙醇和乙醛的积累，减轻了酒精和高脂肪饮食引起的肝脏损伤。虽然目前可用的解酒方法在根本上无法提高酒精代谢能力，但 C68-ALDH1-ADH1 显示出显著的保护作用，为治疗酒精相关疾病提供了新的治疗策略。这些发现表明，C68-ALDH1-ADH1在体内显著减轻了过量饮酒对神经系统的不良影响。过表达的ALDH1和ADH1改变了肝细胞系中的脂肪酸（FA）代谢途径和糖代谢途径。为了阐明ALDH1和ADH1过表达引起的全面转录变化，进行了转录组学分析。如图3A所示，用C68-ALDH1-ADH1处理的WRL68细胞与用C68-EMPTY处理的细胞相比，表现出明显不同的基因表达谱。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，与FA代谢和糖代谢途径相关的基因表达水平显著升高（图3B）。互补基因本体（GO）分析进一步证实了这些发现，表明与脂质和葡萄糖稳态相关的生物过程明显富集（图3C）。

图3 用C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY处理的WRL68细胞的转录组学分析

详细检查代谢途径显示，FA降解和脂滴形成发生了显著变化，这一点从热图中的差异基因表达模式可以看出（图3D）。具体来说，参与FA降解的基因在C68-ALDH1-ADH1组中上调，而与脂滴形成相关的基因则下调。此外，对与糖代谢相关的基因进行了深入分析。考虑到糖酵解和糖异生之间的动态平衡，分析了这两个途径中的关键基因。结果显示，糖异生基因（如GPD1和PCK2）上调，而糖酵解基因（如ALDOC和TPI1）下调（图3E和3F）。这些转录变化表明，ALDH1和ADH1过表达诱导了一种需要减少葡萄糖衍生能量产生的代谢状态。

转录组谱分析显示，参与糖异生和糖酵解的基因表达有显著差异。C68-ALDH1-ADH1组中葡萄糖摄取基因（如SLC2A2）和糖酵解相关基因（如TPI1和ALDOC）的表达降低，表明糖酵解活性和葡萄糖利用受到抑制（图S4）。为了功能验证这些转录变化，使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG通过流式细胞术定量评估了细胞葡萄糖摄取。用C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY处理的WRL68细胞随后暴露于2%的酒精和最低必需培养基（MEM）中。如图4A和4B所示，C68-ALDH1-ADH1处理的细胞比对照组显示出显著降低的葡萄糖摄取量。荧光强度峰的左移进一步证实了ALDH1和ADH1过表达与细胞葡萄糖利用之间的负相关（图4C）。

为了进一步评估ALDH1和ADH1过表达对体内葡萄糖代谢的影响，小鼠通过口服给予8 × 10^10 vp的C68-ALDH1-ADH1或等体积的PBS。16小时后，在禁食8小时后，小鼠被给予6 mL/kg的Erguotou，并在5小时内监测血糖水平（图4D）。C68-ALDH1-ADH1处理的小鼠在整个监测期间保持了更稳定的血糖水平，而C68-EMPTY和PBS组在最初的1小时后血糖水平持续下降。这些结果表明，ALDH1和ADH1过表达促进了代谢灵活性，并保护免受酒精引起的低血糖。

多组学分析显示，ALDH1和ADH1过表达重新编程了酒精诱导的代谢途径。全面的非靶标代谢组学和脂质组学分析揭示了WRL68细胞在C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY处理后酒精刺激下的代谢变化。液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示了广泛的代谢重塑，火山图突出了许多显著上调和下调的代谢物（图5A）。脂质组学分析通过气泡图显示，不同脂质类别的途径富集模式有所不同（图5B）。值得注意的是，在C68-ALDH1-ADH1组中观察到磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺（PC/PE）比例的显著降低，这是脂质生成的一个关键决定因素（图5C）。此外，甘油磷脂的比较分析显示，C68-ALDH1-ADH1处理组中的大多数亚类都显著下调（图5D）。甘油三酯亚类也表现出类似的趋势，与C68-EMPTY组相比明显减少（图5E）。

这些数据表明，ALDH1和ADH1过表达促进了代谢灵活性，并保护免受酒精引起的低血糖。结合转录组学和代谢组学数据的综合多组学分析验证了这些发现，揭示了代谢途径的协调变化。这些发现强调了ALDH1和ADH1过表达对代谢网络的广泛重组。

FAR2介导脂质代谢和酒精之间的双向相互作用。在确定了脂质代谢和酒精代谢之间的联系后，我们旨在确定关键调控基因如何调节脂质代谢动态。对参与脂质代谢的不同表达基因的热图分析（图6A）揭示了几种候选调控因子，随后通过RT-qPCR进行了验证（图6B）。其中，脂肪酸酰辅酶A还原酶2（FAR2）因其在脂肪醇循环中的作用而被优先研究。Western blotting结果进一步证实了C68-ALDH1-ADH1组中FAR2蛋白水平的升高（图6C）。通过PCAGGS载体独立表达ALDH1、ADH1或两者，也验证了FAR2的表达过表达（图S7）。值得注意的是，任何一种酶的单独过表达或组合过表达都导致FAR2表达显著上调（图6D），这一点通过Western blotting得到了证实（图6E）。

鉴于ALDH1和ADH1过表达在转录和翻译水平上都上调了FAR2，我们接下来探讨了FAR2是否反过来影响ALDH1、ADH1和酒精代谢。使用经过验证的短发夹RNA（shRNA）构建体（shFAR2-1和shFAR2-2）（图6F）发现，FAR2下调显著降低了酒精代谢能力（图6G），表现为乙醇清除率降低（图6G）。为了进一步研究FAR2是否调节ALDH1和ADH1的表达，我们检查了用C68-ALDH1-ADH1转导后经过FAR2下调的WRL68细胞。C68-ALDH1-ADH1诱导的FAR2 mRNA表达在shFAR2处理后显著降低（图6H）。值得注意的是，FAR2下调也降低了ALDH1和ADH1的mRNA和蛋白水平，这一点通过Western blotting得到证实（图6I）。为了评估功能后果，我们重复了酒精代谢测定，观察到FAR2下调组中的乙醇浓度升高，表明酒精清除能力受损（图6J）。这些结果共同揭示了一种双向调节关系，其中FAR2不仅响应ALDH1和ADH1的过表达，还增强了它们的表达并提高了酒精代谢能力。

将这些发现与多组学数据结合起来，揭示了一个以FAR2为中心的协调代谢网络。该网络的关键组成部分包括甘油酮磷酸O-酰基转移酶（GNPAT）和烷基甘油酮磷酸合酶（AGPS），它们共同形成了参与醚脂生物合成的活性异三聚体复合体。RT-qPCR分析证实，C68-ALDH1-ADH1组中GNPAT和AGPS均上调（图S8），突出了FAR2在连接脂质代谢途径和增强酒精解毒能力中的核心作用。

C68-ALDH1-ADH1治疗通过靶向脂肪醇代谢改善了高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝（NAFLD）。先前的研究表明，脂肪醇代谢与脂质稳态密切相关，FAR2在调节脂肪醇循环中起着关键作用。在本研究中，我们观察到C68-ALDH1-ADH1显著上调了FAR2的表达，这可能是NAFLD的一个关键靶点。因此，需要进一步探索C68-ALDH1-ADH1在高脂饮食（HFD）诱导的NAFLD中的治疗潜力。实验时间线详细说明了每周给HFD喂食的小鼠口服C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY的过程，同时进行连续血液采样和最终肝脏采样（图7A）。

这些数据表明，C68-ALDH1-ADH1缓解了HFD小鼠的肝损伤标志物。刻度尺，200 μm 或 100 μm。(I) 通过实时PCR测量了PPARα、ALDH3A1、SREBF1和DGAT2在mRNA水平上的表达。(J) 酒精代谢与脂肪醇循环之间的简化示意图连接。数据以平均值±标准差表示。差异通过单因素方差分析(ANOVA)或Student’s t检验进行分析。?，p ≤ 0.05；??，p ≤ 0.01；???，p ≤ 0.001；以及????，p ≤ 0.0001。为了评估C68-ALDH1-ADH1的肝脏保护作用，量化了氧化应激生物标志物。丙二醛(MDA)是脂质过氧化的副产品，是细胞损伤的指标，在血清和肝组织中进行了测量。与C68-EMPTY组相比，接受C68-ALDH1-ADH1处理的小鼠血清中的MDA水平显著降低（图7B）和肝样本中也是如此（图7D）。此外，超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增加，这是对抗活性氧(ROS)的关键抗氧化防御机制（图7C和7E）。为了评估肝脏损伤，测量了ALT和AST的水平。与对照组相比，C68-ALDH1-ADH1组的ALT和ALT/AST比率显著降低（图7F），证实了C68-ALDH1-ADH1对肝脏损伤的保护作用。为了进一步评估肝脏损伤，使用H&E和Oil Red O染色对肝切片进行了病理学分析（图7G和7H）。根据NAS（非酒精性脂肪肝病活动评分）标准对H&E染色切片进行评分，并对Oil Red O染色的样本中的脂质积累进行量化，结果显示C68-ALDH1-ADH1处理组有显著改善。此外，还使用RT-qPCR分析了与NAFLD和脂肪醇循环相关的关键基因（图7I）。ALDH3A1是参与脂肪醇循环的基因，在C68-ALDH1-ADH1组中显著上调，表明脂肪醇循环增强。此外，过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)的表达显著增加，这是FA代谢的关键调节因子，表明脂肪积累减少。相反，与脂质生成相关的基因SREBF1及其下游靶标DGAT2在C68-ALDH1-ADH1组中下调，表明脂质合成受到抑制。这些协调的基因表达变化表明C68-ALDH1-ADH1有效调节了肝脏的脂质代谢（图7J）。

讨论
目前，加速乙醇代谢的有效策略有限。现有的干预措施主要是为了减轻乙醇代谢产物的毒性作用或保护胃黏膜，以减少酒精的毒性影响。针对乙醇代谢的核心酶途径是一种有前景的治疗方法。然而，到目前为止，还没有研究使用酶传递策略来缓解酒精中毒。
ALDH和ADH是乙醇代谢中的两个关键酶。腺病毒载体是成熟的基因传递工具，具有已证明的安全性和有效性。在这项研究中，我们使用腺病毒载体传递ALDH1和ADH1，旨在增强酒精代谢。我们的发现表明，重组载体C68-ALDH1-ADH1在体外和体内模型中有效加速了乙醇的清除，减少了小鼠的酒精诱导损伤，并缓解了与酒精代谢相关的代谢紊乱。
肌肉注射腺病毒载体通常会引起强烈的载体特异性免疫反应，这可能会限制后续的给药。相比之下，口服给药受先前对载体的免疫反应的影响较小，允许重复给药。在我们的研究中，三次重复口服C68-ALDH1-ADH1显著增强了酒精代谢，显示出其持续治疗的潜力。
ALDH1和ADH1的过表达减少了有毒乙醛的积累，从而降低了肝脏损伤。这种保护作用在多个指标中都很明显，包括血清中酒精和乙醛水平的持续且显著降低。此外，肝脏损伤标志物如ALT和AST也减少了，组织病理学分析显示只有轻微的肝脏损伤，总体上表明ALD的风险降低。从病理学角度来看，高浓度的酒精和乙醛可引起内质网应激并导致脂肪细胞死亡，这是酒精性肝损伤的重要过程。这一观点得到了ADH1缺陷小鼠模型的进一步支持，在这些模型中，急性酒精给药会导致血清酒精浓度和转氨酶水平显著升高，从而引起内质网应激，并伴随严重的肝脏损伤。除了酒精和乙醛的直接毒性外，过量乙醇的摄入还可能产生非氧化代谢物，这些代谢物也会导致肝脏损伤。
除了在酒精代谢中的作用外，ALDH1和ADH1的更广泛的代谢效应还需要进一步研究。先前的研究表明，ALDH1可以促进由RIG-1和MAVS介导的抗病毒信号通路，而ADH1作为长寿通路的下游效应器，其激活已被证明可以延长从酵母到人类的健康总寿命。这些发现表明C68-ALDH1-ADH1可能会影响更广泛的代谢调节方面。
多组学分析显示，C68-ALDH1-ADH1通过影响酒精代谢途径调节糖代谢和脂质代谢。葡萄糖摄取测定表明，酒精抑制糖异生，损害了从头合成葡萄糖的过程。值得注意的是，在C68-ALDH1-ADH1组中，糖酵解下调，而糖异生显著增强。相比之下，C68-EMPTY组的酒精浓度较高，显示出更大的对外部环境的葡萄糖依赖性以满足其能量需求，这与先前的研究一致。因此，C68-ALDH1-ADH1可能有助于减轻急性酒精暴露后的低血糖风险。ALDH1和ADH1主要位于肝细胞的细胞质中，这与其在乙醇代谢中的功能一致。细胞质中的乙醇代谢与细胞氧化还原平衡和脂质代谢密切相关。乙醇氧化的增加提高了NADH/NAD+比率，这可能会促进肝脏脂质积累和代谢应激。乙醇代谢和醛积累也与氧化应激和肝脏脂质稳态的失调有关。因此，我们推测增强的细胞质ADH1/ALDH1活性不仅有助于乙醇解毒，还可能通过减少与醛相关的代谢应激和改善肝脏代谢稳态间接调节脂质代谢途径。
此外，饮酒通常会促进脂质生成，并导致生物活性脂质（如脂肪酸和磷脂）的积累，从而导致非酒精性脂肪肝(AFLD)的发展。先前的研究表明，乙醇灌胃显著增加了肝脏游离脂肪酸(FFAs)和甘油三酯水平，进一步加剧了脂质失调。在C68-ALDH1-ADH1组中，酒精的不良影响通过增强的脂肪酸氧化得到缓解。这些发现与对照组中观察到的脂质积累增加一致。此外，特定类型脂质的调节，如PC和PE比率的下调，也表明脂质生成减少。
肝脏主动吸收肝脏FFAs，并将其中一部分酯化为甘油三酯。肝脏脂质代谢受到复杂的转录因子和细胞内信号通路网络的严格调控。酒精通过直接和间接机制破坏肝脏脂质流动，最终促进脂质积累。值得注意的是，乙醇代谢诱导脂质过氧化，产生活性脂质自由基，损害FFAs的β-氧化，从而加重肝脏脂质积累。血液中乙醇浓度的升高刺激肝脏FFAs的合成，同时诱导脂肪组织中的脂肪细胞脂解和细胞死亡，导致血清FFAs和FFA乙酯(FAEEs)水平升高。乙醛是乙醇的主要氧化代谢物，通过促进肝细胞脂质积累、炎症和纤维化甚至致癌作用，引发广泛的肝脏损伤。这些病理效应是由过量的脂质流入和肝脏细胞系中的脂质清除受损共同驱动的。肝细胞脂质积累被认为是ALD的早期特征。更深入地了解肝细胞脂质代谢可能为高风险ALD个体的早期干预和治疗提供新的策略。
除了ALD之外，过量的肝脏脂质积累也是NAFLD的关键病理特征。在我们的研究中，C68-ALDH1-ADH1有效缓解了NAFLD，这通过改善肝功能指标得到证实。这种治疗效果可能是通过FAR2依赖的脂肪醇循环介导的，在该循环中，NADPH提供高能电子以补偿乙醇代谢过程中消耗的电子。支持这一机制的是，我们观察到脂肪醇代谢酶ALDH3A1和PPARα的上调。值得注意的是，先前的研究表明，乙醇通过激活SREBP-1和DGAT2的转录活性加剧了ALD。同样，NAFLD的进展与SREBP-1/DGAT2途径的抑制途径受损有关，导致从头脂质生成增强。与这些发现一致，我们的结果表明C68-ALDH1-ADH1下调了SREBP-1和DGAT2的表达，进一步支持其在恢复代谢稳态中的作用。
众所周知，饮酒会加剧ALD的发病机制。代谢综合征与酒精代谢能力受损之间的相互作用显著增加了患ALD的风险。在这项研究中，我们开发了一种新型的腺病毒载体介导的基因传递系统，针对乙醇代谢中的两个关键酶ALDH1和ADH1。全面的体外和体内分析证实，C68-ALDH1-ADH1显著增强了酒精到乙醛和乙醛到醋酸的转化催化效率。除了其主要解毒作用外，C68-ALDH1-ADH1还表现出对糖代谢和脂质代谢途径的显著调节作用。值得注意的是，这项研究揭示了FAR2、ALDH1和ADH1在调节酒精和脂质代谢中的先前未报告的关联。总的来说，这些发现表明C68-ALDH1-ADH1作为一种创新的酒精解毒和治疗脂肪肝疾病的药物具有巨大的潜力。然而，需要进一步的研究来评估其长期疗效和安全性，特别是在非人类灵长类等大型动物模型中的效果。
本研究的几个局限性需要在未来的研究中加以考虑。首先，C68-ALDH1-ADH1的体内疗效仅在中性小鼠中进行了评估，未考虑潜在的性别依赖性代谢差异。其次，体外实验主要使用WRL68细胞进行，这种永生化肝细胞系可能无法完全复制原代肝细胞的代谢特性或肝脏的复杂细胞环境。第三，尽管我们的转录组、表达和功能丧失实验支持FAR2和ALDH1/ADH1介导的酒精代谢在体外具有功能关联，但仍需在体内建立明确的因果机制和FAR2与观察到的代谢效应之间的因果关系。最后，C68-ALDH1-ADH1的治疗效果是在包括酒精暴露和HFD诱导的NAFLD在内的实验模型中评估的；因此，需要使用其他疾病模型和长期评估来确定这些发现的普遍性、持久性和转化潜力。
资源可用性
联系人请求
如需进一步信息、资源和试剂，请联系联系人Dongming Zhou（[e-mail]）。
材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。
数据和代码可用性
•原始RNA测序数据已存放在NCBI BioProject中，访问号为PRJNA1367304。原始的非靶向代谢组学测序数据已存放在CNGBdb中，访问号为CNP0008518。
•本文未报告原始代码。
•如需重新分析本文中报告的数据，可向联系人请求额外信息。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82241065）和中国国家自然科学基金青年科学家计划（项目编号82302061）的支持。
作者贡献
D.Z. 设计了该项目。Y.Y. 进行了大部分实验。X.W.、H.S. 和 C.Z. 参与并协助了动物实验。Y.Y.、X.W.、M.X. 和 M.W. 收集并分析了数据。D.Z. 和 X.W. 获得了资金支持。Y.Y. 起草了手稿。D.Z. 和 X.W. 审阅了手稿。所有作者均已阅读并同意发表的手稿版本。
利益声明
作者声明没有竞争利益。
STAR
方法
关键资源表
试剂或资源
来源标识符
抗体
ALDH1A1 多克隆抗体
Proteintech
Catalog No. 15910-1-AP；RRID:AB_2305276
ADH1A 多克隆抗体
Proteintech
Catalog No. 17998-1-AP；RRID:AB_3741941
NOX1 抗体
abcam
PA5-103220；RRID:AB_2852587
FAR2 兔子多克隆抗体
ORIGIN
CAT #:TA349964；RRID:AB_3757045
GAPDH 抗体
NCM Biotech
Catalog No. AB2020；RRID: AB_3757046
化学品、肽和重组蛋白
重组腺病毒载体 AdC68XY3
Zhou’s Lab
N/
关键商业检测
细胞/组织总RNA快速提取试剂盒
NCM Biotech
N/A
PrimeScript? RT 试剂盒含gDNA Eraser
Takara
N/A
乙醇检测试剂盒
南京建诚生物工程研究所
N/
乙醛检测试剂盒
Megazyme
N/
天冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）
南京建诚生物工程研究所
N/
丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）
南京建诚生物工程研究所
N/
存档数据
RNA-seq和数据
本文
PRJNA1367304
非靶向代谢组学测序
本文
CNP0008518
实验模型：细胞系
WRL68细胞
宁波明洲生物有限公司
N/
HEK293细胞
ATCC
N/
AMRC-5
ATCC
N/
实验模型：生物体/菌株
ICR雄性小鼠
北京四bett生物技术有限公司
N/
C57BL/6小鼠喂食高脂饮食（D12492，Research Diets Inc）12周。
Southern Model Organisms
N/
软件和算法
Adobe Illustrator
Adobe
N/
GraphPad Prism 8
GraphPad软件
N/
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实验模型和研究参与者详情
细胞培养和处理
HEK293细胞、L-02细胞和MRC-5细胞从ATCC（美国）购买，并用完全的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Gibco，美国）维持，并添加10%胎牛血清（Gibco，美国）和1%青霉素和链霉素（新细胞与分子生物技术，中国）。WRL68细胞从宁波明洲生物有限公司购买，并在添加了10%胎牛血清（Gibco，美国）、1%青霉素和链霉素（New Cell & Molecular Biotech，中国）以及1% GlutaMAX（Gibco，美国）的最小必需培养基中维持生长。这些细胞在37°C和5%二氧化碳的环境下孵育。在分发之前，这些细胞系已经由供应商进行了鉴定。未进行额外的内部细胞系鉴定。所有细胞培养物均通过基于PCR的测试确认没有支原体污染。

**动物和处理**
6-8周龄、体重超过20克的ICR雄性小鼠从北京四惠福生物技术有限公司购买，并饲养在上海公共卫生临床中心的生物安全实验室中。C57BL/6小鼠从Southern Model Organisms购买，这些小鼠已被喂食高脂饮食（D12492，Research Diets Inc）12周。所有小鼠在无菌条件下饲养，每周有12小时的黑暗/光照周期，并且可以自由获取水和食物。所有动物实验均获得了上海公共卫生临床中心的机构动物护理和使用委员会以及生物安全委员会的批准。本研究也获得了复旦大学上海公共卫生临床中心伦理委员会的批准（伦理审查批准编号为2025-A067-01）。

**方法细节**
**重组腺病毒构建**
重组腺病毒载体AdC68XY3是在我们的实验室中构建的。质粒pAAV-TBG和pAAV-ALDH1F2AADH1经过密码子优化后由Tsingke Biology公司合成。TBG启动子和ALDH1被插入到E1缺失区域，而人类巨细胞病毒（CMV）启动子和ADH1则通过限制性内切酶切割位点连接插入到E3缺失区域。C68-ALDH1-ADH1在HEK293细胞中 rescued并扩增。随后通过氯化铯密度梯度超速离心纯化C68-ALDH1-ADH1。病毒滴度通过在260 nm处测量吸光度来确定。对照腺病毒C68-EMPTY也是由我们的实验室提供的。

**Western Blotting**
WRL68细胞分别用不同量的C68-ALDH1-AHD1和C68-EMPTY处理24小时，然后使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（Beyotime，中国）裂解细胞。C68-EMPTY作为阴性对照，而用PBS处理的WRL68细胞作为空白对照。细胞裂解液进行电泳后转移到PVDF膜上。在室温下用5%牛奶封闭2小时后，膜与一抗孵育2小时，随后用HRP结合的二抗在室温下孵育1小时。GAPDH用作归一化对照。抗体的具体信息列在关键资源表中。

**定量实时PCR (qRT-PCR)**
WRL68细胞以每孔2 × 10^5个细胞的密度接种在24孔板中。24小时后，使用10^6、5 × 10^6、10^7vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY感染WRL68细胞。用PBS处理的WRL68细胞作为空白对照。24小时后，根据制造商的方案使用Cell/Tissue total RNA快速提取试剂盒（NCM Biotech）提取细胞的总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser（Takara）将其逆转录为cDNA。目标基因的表达通过StepOnePlus Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）和SYBR premix Ex Taq（Takara）进行qRT-PCR分析。为了量化目标基因，将其归一化到管家基因GAPDH。使用的引物列在表S1中。对于时间梯度实验，使用10^6vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY感染接种在24孔板中的WRL68细胞。24小时、48小时和72小时后收集细胞并提取RNA。后续步骤与上述相同。

**ICR小鼠处理**
ICR小鼠口服给予8 × 10^10vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY，这些病毒已溶解在200 μL的PBS中。空白组的小鼠给予200 μL的PBS。24小时、48小时、72小时和1周后，对小鼠实施安乐死并收集肝叶。按照上述方法提取组织总RNA、进行逆转录和qRT-PCR。

**其他实验**
构建了PCAGGS-ALDH1-ADH1、PCAGGS-ALDH1并将其转染到WRL68细胞中，然后检测转染后WRL68细胞中FAR2的mRNA表达水平。操作步骤与上述相同。

**细胞乙醇测定**
WRL68细胞以每孔2 × 10^5个细胞的密度接种在24孔板中。24小时后，使用10^6、5 × 10^6、10^7vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY感染WRL68细胞。用PBS处理的WRL68细胞作为空白对照。处理24小时后，将细胞培养基更换为含有2%乙醇的MEM。30分钟后，收集细胞培养基的上清液，并使用乙醇测定试剂盒（南京建成生物工程技术研究院）检测其乙醇浓度。

**L-02细胞和MRC-5细胞处理**
L-02细胞和MRC-5细胞以每孔2 × 10^5个细胞的密度接种在24孔板中。24小时后，使用10^6、5 × 10^6、10^7vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY感染L-02和MRC-5细胞。用PBS处理的L-02和MRC-5细胞作为空白对照。处理24小时后，将细胞培养基更换为含有2%乙醇的RPMI-1640或Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）。30分钟后，收集细胞培养基的上清液，并使用乙醇测定试剂盒（南京建成生物工程技术研究院）检测其酒精浓度。

**ICR小鼠的酒精测定、体重减轻和存活率**
将8 × 10^10vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY稀释在200 μL的PBS中，然后口服给予ICR小鼠。将小鼠分为三组，分别给予C68-ALDH1-ADH1、C68-EMPTY或PBS。24小时后，在给予酒精前称量小鼠的体重。酒精以6 mL/kg的剂量使用56%体积分数的Erguotou（红星）给予。24小时、48小时、72小时和1周后对小鼠实施安乐死并收集肝叶。按照上述方法提取组织总RNA、进行逆转录和qRT-PCR。

**其他实验**
构建了PCAGGS-ALDH1-ADH1，将其转染到WRL68细胞中，然后检测转染后WRL68细胞中FAR2的mRNA表达水平。操作步骤与上述相同。

**LORR实验**
LORR（恢复直立反射）定义为动物在翻倒时无法迅速恢复直立位置的能力。将8 × 10^10vp的C68-ALDH1-ADH1和PBS分别口服给予各组ICR小鼠。24小时后，在给予酒精前称量小鼠的体重。酒精以10 mL/kg的剂量使用56%体积分数的Erguotou（红星）给予。记录LORR发生的时间和持续时间，直到小鼠恢复正常活动。

**乙醛测定**
WRL68细胞以每孔2 × 10^5个细胞的密度接种在24孔板中。24小时后，使用10^6、5 × 10^6、10^7vp的C68-ALDH1-ADH1和C68-EMPTY感染WRL68细胞。用PBS处理的WRL68细胞作为空白对照。处理24小时后，将细胞培养基更换为含有2%乙醇的MEM。30分钟后，收集细胞培养基的上清液，并使用乙醛测定试剂盒（南京建成生物工程技术研究院）检测其乙醛浓度。

**ALT和AST测定**
使用市售的测定试剂盒（南京建成生物工程技术研究院，中国）测量天冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）和丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）的水平。按照试剂盒的方案严格添加所有成分，并在510 nm波长处测量光密度（OD）值。通过减去空白孔的吸光度来校正每个孔的吸光度。然后以OD值的绝对差作为横坐标，相应的Karman单位作为纵坐标，利用试剂盒提供的标准样品浓度构建标准曲线。根据操作说明，使用标准孔的吸光度值进行多项式回归分析（R2 ≥ 0.99）。得到的回归方程用于样品分析。

**准确称量0.1克肝脏，并加入0.9毫升生理盐水。在冰面上以2500rpm离心10分钟。将上清液用生理盐水稀释10倍，并使用BCA试剂盒检测蛋白质浓度。取等量的蛋白质并稀释至相同的浓度/体积。然后按照之前的方案使用乙醛测定试剂盒（Megazyme）测定乙醛浓度。**

**高通量mRNA测序**
WRL68细胞以每孔10^6个细胞的密度接种在6孔板中。24小时后，使用2.5 × 10^7vp的C68-ALDH1-ADH1感染三个样本，以及两个样本使用C68-EMPTY。24小时后收集细胞并送上海Personal Biotechnology有限公司进行RNA测序。首先使用Trizol Reagent（Invitrogen Life Technologies）提取总RNA，并使用NanoDrop光谱仪（Thermo Scientific）确定其浓度、质量和完整性。使用TruSeq RNA Sample Preparation Kit（Illumina，加州圣地亚哥）生成测序文库。从总RNA中通过poly-T oligo-附着磁珠纯化mRNA。在Illumina专有的片段化缓冲液和高温下使用二价阳离子进行片段化。首先使用随机寡核苷酸和SuperScript II合成第一链cDNA，然后使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二链cDNA。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余的突出末端转化为平末端，并去除这些酶。在DNA片段的3′末端加上腺苷酸后，使用Illumina PE接头寡核苷酸进行连接以备杂交。使用AMPure XP系统（Beckman Coulter，加州贝弗利）选择200 bp长度的cDNA片段进行纯化。然后使用Agilent high sensitivity DNA assay在Bioanalyzer 2100系统上对片段进行定量。使用featureCounts (v1.5.0-p3)获得每个基因的读取计数，并将其标准化为每千碱基百万（FPKM）的片段。使用DESeq2 (v1.20.0)根据log2FC > 1和p < 0.05识别差异表达基因（DEGs）。

**非靶向代谢组学测序**
WRL68细胞以每皿8 × 10^6个细胞的密度接种在10厘米培养皿中，并分别用2 × 10^8vp的C68-ALDH1-ADH1处理四个重复组和五个重复组。24小时后，将细胞培养基更换为含有2%乙醇的MEM。30分钟后，移除培养基并用PBS清洗细胞两次。不同组的细胞培养皿立即放在冰面上。向培养皿中加入80%甲醇溶液（含内标混合物），覆盖整个培养皿表面，放在-80°C的冷冻柜中15分钟以失活酶，然后将细胞提取物转移到2毫升离心管中。在4°C下以14000xg离心10分钟并收集上清液。混合每个样本的上清液以制备PQC样本。真空冷冻干燥后，将样品重新悬浮在100 μL的10%甲醇/90%水溶液中，涡旋30秒，超声处理1分钟，以14000xg离心4分钟，然后将上清液转移到样品小瓶中进行质谱分析。色谱和LC-MS分析由Repugene公司完成，使用配备加热电喷雾离子化（HESI）源的Q Exactive HF-X（QE-HF-X）质谱仪。代谢物的检测和鉴定是通过MS-dial（版本5.1.230912）根据在线数据库（MoNA、GNPS、HMDB和MS-dial数据库）及内部数据库进行搜索来实现的。差异表达的代谢物需满足VIP>1、FC>1.5/FC<0.67且p<0.05的标准。

非靶向脂质组学测序的细胞处理步骤与先前描述的非靶向代谢组学测序步骤相同。脂质的提取采用MTBE方法：首先向样品中加入200 μL水并涡旋5秒，然后加入240 μL预冷却甲醇并涡旋30秒，接着加入800 μL MTBE，在4°C下超声处理20分钟，室温下静置30分钟。混合物在10°C下以14000g离心15分钟，取上层有机溶剂层并在氮气下干燥。反向相色谱分离使用CSH C18柱（1.7 μm，2.1 mm × 100 mm，Waters）。脂质提取物重新溶解在200 μL 90%异丙醇/乙腈混合液中，以14000g离心15分钟，最后取3 μL样品进行检测。溶剂A为乙腈-水（6:4，v/v）加入0.1%甲酸和0.1 mM甲酸铵；溶剂B为乙腈-异丙醇（1:9，v/v）加入0.1%甲酸和0.1 mM甲酸铵。起始流动相为30%溶剂B，流速为300 μL/min，保持2分钟后线性增加到100%溶剂B，持续23分钟，最后平衡在5%溶剂B中10分钟。质谱数据分别在正模式和负模式下使用Q-Exactive Plus采集。ESI参数已优化并预设如下：源温度300°C，毛细管温度350°C，离子喷射电压设为3000V，S-Lens射频水平设为50%，仪器扫描范围设定为m/z 200–1800。

WRL68细胞以5 × 10^6个细胞/孔的密度接种，并用7.5 × 10^7 vp/dish的C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY处理。为了评估葡萄糖的摄取，先将细胞用无葡萄糖的DMEM（Gibco，美国）洗涤两次，在37°C下孵育10分钟，然后更换为含有2%乙醇的无葡萄糖DMEM。孵育5分钟后加入2-NBDG（ThermoFisher，N13195），最终浓度为300 μM，继续在37°C下孵育25分钟。用PBS + 5% FBS洗涤两次后，样品重新悬浮并用BD LSRFortessa（BD Biosciences）进行分析，数据使用FlowJo 10.8.1软件处理。

ICR小鼠随机分为三组，分别给予8 × 10^10 vp的C68-ALDH1-ADH1、C68-EMPTY或等量的PBS。禁食24小时后，给小鼠灌胃6 mL/kg的Erguotou。通过剪尾采集血液，每小时使用血糖仪（Roche）检测一次血糖水平，共检测5次。

我们使用含有插入位点的pLKO.1 TRC-cloning载体作为表达载体。设计的shFAR2序列包含两个寡核苷酸片段shFAR2-1和shFAR2-2。引物信息及合成工作由Azenta（中国）完成：
shFAR2-1：5′-CCGGCATGAGAAGATCAGAGCTATTCTCGAGAATAGCTCTGATCTTCTCATGTTTTTG-3′
shFAR2-2：5′-CCGGCCACATTACATCTGGTAACATCTCGAGATGTTACCAGATGTAATGTGGTTTTTG-3′

pLKO.1载体经过AgeI和EcoRI限制性内切酶消化后，通过凝胶提取纯化。将5 μg的正向和反向寡核苷酸与5 μL 10x NEB缓冲液（New England Biolabs Restriction Endonuclease Reaction Buffer 2）和35 μL ddH2O混合，95°C下孵育4分钟后，在70°C水中孵育10分钟。利用T4DNA连接酶将寡核苷酸连接到pLKO.1载体上，并在16°C下过夜孵育。将连接产物转染到STBL3感受态细胞中，然后接种在含有氨苄西林的LB琼脂平板上。HEK293T细胞接种在6孔板中，待细胞密度达到约70%后，转染900 ng的包装质粒（pCMV-dR8.91）、100 ng的包膜蛋白（VSV-G/pMD2G）和1 μg的构建shRNA。孵育18小时后，将培养基更换为含有30% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM。再孵育24小时后，收集含有慢病毒的培养基。

WRL68细胞以2 × 10^5个细胞/孔的密度接种在24孔板中，每个孔加入40 μL的三种慢病毒（shFAR2-1、shFAR2-2和shvector）。24小时后，每个孔加入5 × 10^6 vp的C68-ALDH1-ADH1。24小时后，将培养基更换为含有2%乙醇的MEM。30分钟后收集细胞上清液进行酒精测定。

WRL68细胞以2 × 10^5个细胞/孔的密度接种在24孔板中，每个孔加入40 μL的三种慢病毒（shFAR2-1、shFAR2-2和shvector）。24小时后，将PCAGGS-ALDH1F2AADH1转染到WRL68细胞中，24小时后更换为含有2%乙醇的MEM。30分钟后收集细胞上清液进行酒精测定。

C57BL/6小鼠喂食高脂肪饮食（D12492，Research Diets Inc）12周。实验方案如图7A所示。小鼠分为两组，分别口服给予8 × 10^10 vp的C68-ALDH1-ADH1或C68-EMPTY，稀释后加入200 μL PBS中。口服后一天采集血液样本，重复实验三次。实验结束后对小鼠实施安乐死并收集肝脏样本，从每只小鼠相同解剖部位取肝叶进行病理评估。完整的肝叶用4%福尔马林固定，包埋在石蜡中切成5 μm厚的切片，送至上海Reibaohe Biotech有限公司进行H&E染色分析。基于之前的研究，制定了综合的病理损伤评分标准（见表S3）。

肝脏脂质沉积通过组织化学方法检测中性脂质来评估。肝组织用Tissue-OCT化合物 freeze，冷冻切片厚度为10 mm，用4%福尔马林固定15分钟，然后用油红O染色。染色工作液通过将饱和油红O原液与去离子水（3:2）稀释制备。使用前，将最终溶液通过0.2毫米滤纸过滤。将浸泡过的组织样品放入工作液中，在45°C的烤箱中孵育10分钟，然后用60%异丙醇洗涤以去除非特异性染色。采用ImageJ软件测量脂质沉积面积，并计算脂质沉积占整个肝表面的比例。

统计分析使用GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行，以评估组间差异。数据以均值±标准误（SEM）表示，星号表示统计显著性（?p < 0.05、??p < 0.01、??p < 0.001、???p < 0.0001）。p值<0.05被视为显著。所有实验的数据至少代表两次独立实验的结果。两组间的数据比较使用Student’s t检验，多组间的比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）。卡方检验用于比较组间的存活率。

补充信息（5）
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文档S1：图表S1–S8
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表S1：RT-qPCR引物
电子表格（10.44 KB）
表S2：乙醛测量方案
电子表格（10.13 KB）
表S3：肝脏病理损伤评分
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数据S1：未裁剪和未编辑的Western印迹原始图像