四环素暴露破坏蜜蜂肠道菌群与免疫-抗氧化稳态

《Insects》：Tetracycline Exposure Disrupts Gut Microbiota and Immune–Antioxidant Homeostasis in Honey Bees

　　

摘要专业翻译 抗生素暴露可扰乱蜜蜂的肠道菌群，但其与宿主生理反应之间的关联尚未被完全理解。本研究在受控的实验室笼养条件下，探究了四环素暴露对西方蜜蜂（Apis mellifera）工蜂存活率、运动活性、肠道细菌群落以及免疫和抗氧化相关基因表达的影响。研究人员发现，100、300和450 μg/mL的四环素暴露以浓度依赖性方式降低了工蜂存活率，而100 μg/mL浓度提高了光照期运动活性，且未影响蔗糖消耗量。四环素还改变了肠道细菌群落结构，多个核心类群显著减少，尤其是斯诺德格拉斯氏菌（Snodgrassella）和巴尔通体菌（Bartonella），而共栖杆菌（Commensalibacter）和乳酸杆菌（Lactobacillus）Firm4及Firm5则增加，尤其在最高浓度下最为明显。免疫和抗氧化相关基因表达的变化在肠道中比在头部更为显著。此外，Snodgrassella丰度与头部Relish表达以及肠道Apidaecin和CAT表达呈正相关。这些发现表明，四环素暴露降低了蜜蜂存活率，并与肠道细菌群落及宿主生理反应的协同改变相关联。

论文解读

一、研究背景与科学问题

蜜蜂（Apis mellifera）是农业和自然生态系统中的重要传粉媒介，对作物生产和生态系统功能具有重要贡献。蜜蜂健康受到多种生物和非生物胁迫因子的影响，包括病原体、寄生虫、农药、营养胁迫以及肠道菌群变化。成年工蜂拥有一个特化的肠道细菌群落，参与营养利用、病原体防御和宿主生理调节。该群落的紊乱可能产生超越微生物组成变化本身的深远后果。

抗生素在养蜂业中历史上被用于控制细菌性疾病，尤其是美洲和欧洲幼虫腐臭病。然而，由于蜂蜜中抗生素残留、抗菌素耐药性以及抗生素对细菌芽孢效果有限等担忧，许多国家（尤其是欧洲）已禁止或严格限制在蜂群中使用抗生素。尽管如此，四环素类抗生素在一些地区仍被用于养蜂，实验研究已证明抗生素暴露可破坏有益肠道细菌并对蜜蜂健康产生不利影响。抗生素暴露可扰乱已建立的肠道细菌群落，导致微生物多样性降低、对机会性病原体的易感性增加以及工蜂死亡率升高。长期抗生素暴露还促进了蜜蜂肠道菌群中抗生素耐药决定因子的积累。近年来，抗生素相关的菌群变化已被发现与蜜蜂免疫应答改变和行为级型转变相关联。

本研究开展的科学动因在于：不同四环素浓度对蜜蜂存活率、运动活性、肠道菌群以及免疫-抗氧化反应的影响尚未被充分理解；肠道菌群与免疫和氧化还原稳态密切相关，抗生素引起的微生物扰动可能与宿主免疫和抗氧化反应的变化同时发生；抗生素暴露、细菌群落变化、行为和组织特异性宿主反应之间的关联尚未完全阐明。基于此，研究人员提出假设：四环素暴露会改变肠道细菌群落，并伴随宿主免疫和抗氧化稳态的变化，最终影响蜜蜂健康。

二、研究内容与主要结论

本研究系统探究了分级四环素暴露（100、300和450 μg/mL）对工蜂存活率、运动活性、肠道细菌群落以及免疫和抗氧化相关基因表达的影响，并进一步分析了优势肠道细菌类群与宿主基因表达之间的关联。研究得出以下主要结论：四环素暴露以浓度依赖性方式降低工蜂存活率；低浓度（100 μg/mL）四环素暴露提高光照期运动活性而不影响蔗糖消耗；四环素改变肠道细菌群落结构，显著降低多个核心类群（尤其是Snodgrassella和Bartonella）的丰度，同时增加Commensalibacter和Lactobacillus Firm4及Firm5；免疫和抗氧化相关基因表达的变化在肠道中比头部更显著；Snodgrassella丰度与头部Relish表达及肠道Apidaecin和CAT表达呈正相关。这些发现表明抗生素暴露可能通过扰乱肠道菌群而间接影响蜜蜂健康，为理解抗生素对蜜蜂的多层次负面影响提供了整合视角。

三、关键技术与方法

研究人员从中国农业科学院蜜蜂研究所养蜂场三个蜂群中采集含晚期蛹的巢脾，在实验室条件下孵化并收集新羽化工蜂（<24 h），随机分配至各处理组。为促进肠道菌群建立，研究人员在羽化后第5天用蜂巢采集蜂肠道制备的细菌悬液对蜜蜂进行口服接种。主要技术方法包括：使用Locomotor Activity Monitors（LAMs）在12 h光照：12 h黑暗（LD 12:12）周期下评估蜜蜂运动活性；采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取肠道总DNA，扩增16S rRNA基因V3–V4区并在Illumina MiSeq平台（PE300）测序，通过QIIME2和DADA2进行质控和扩增子序列变异（ASVs）推断；使用TRIzol法提取头部和肠道组织总RNA，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测免疫和抗氧化相关基因表达，以β-actin为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量；通过qPCR结合质粒标准曲线对目标细菌类群进行绝对定量；使用Kaplan–Meier法分析存活曲线，采用Student's t-检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey's HSD多重比较进行统计检验。

四、研究结果

3.1 四环素暴露降低蜜蜂存活率并改变运动活性

四环素暴露显著降低工蜂存活率，且存活率随暴露浓度从100 μg/mL增至450 μg/mL而逐步下降。至第13天，对照组、100、300和450 μg/mL四环素组的平均累积死亡率分别为20%、55.56%、88.33%和100%。与对照组相比，100、300和450 μg/mL组的累积死亡率分别增加35.56、68.33和80个百分点，表明观察期内死亡率呈浓度依赖性增加。运动活性实验在100 μg/mL浓度下进行，四环素处理组蜜蜂的总运动活性显著高于对照组，增加主要发生在光照期，且在ZT0–6时段最为显著。蔗糖消耗在处理组和对照组之间无显著差异，表明低浓度四环素暴露改变了运动活性而未检测到蔗糖摄入变化。

3.2 四环素暴露改变蜜蜂肠道细菌群落

四环素暴露对α多样性影响有限：ACE和Chao丰富度指数在各处理间均无显著差异，Shannon指数也无显著变化，Simpson指数总体呈下降趋势但仅在100 μg/mL组与对照组间存在显著差异。在属水平上，Bartonella、Gilliamella、Commensalibacter和Lactobacillus为检测到的优势菌群。四环素暴露与Bartonella相对丰度降低以及Commensalibacter和Lactobacillus相对丰度升高相关。绝对qPCR分析显示，四环素处理组总细菌载量下降，Snodgrassella和Bartonella显著减少，Bifidobacterium在100和300 μg/mL下减少，Gilliamella在300 μg/mL下减少，而Lactobacillus Firm4和Firm5在450 μg/mL下增加，Frischella无显著变化。β多样性分析显示对照组与四环素暴露蜜蜂间群落组成存在明显差异：基于Bray–Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）显示显著处理效应（PERMANOVA，R² = 0.3386，p = 0.001），非度量多维尺度分析（NMDS）/相似性分析（ANOSIM）同样表明组间存在差异（R = 0.3713，p = 0.001）。这些结果表明，尽管α多样性变化有限，四环素暴露仍显著改变了肠道细菌群落的整体结构。

3.3 四环素暴露以组织依赖性方式改变免疫和抗氧化相关基因表达

研究人员检测了头部和肠道中免疫通路基因（PGRP-LC、Toll、Relish）、抗菌肽基因（Abaecin、Apidaecin、Defensin-1、Defensin-2）以及抗氧化相关基因（CAT、MsrA、Sod1、Trxr1）的表达。不同组织间的反应存在差异：在头部，高浓度四环素暴露降低了PGRP-LC表达，而肠道中PGRP-LC无显著变化；Toll表达在两种组织中基本不变；Relish表达在头部呈下降趋势。头部抗菌肽基因无变化，而肠道中多个抗菌肽转录本减少。抗氧化相关基因表达在头部受影响较小，而肠道中CAT和Sod1呈现不同程度的表达下调。总体而言，转录反应在肠道中比头部更为显著。

3.4 优势肠道细菌与宿主免疫-抗氧化基因表达之间的关联

研究人员对关键细菌类群的绝对丰度与免疫和抗氧化相关基因表达水平进行了Spearman相关分析，揭示出组织特异性的相关模式。在头部，Snodgrassella丰度与Relish表达呈正相关；在肠道，Snodgrassella丰度与Apidaecin和CAT表达呈正相关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，与先前关于传粉昆虫和无脊椎动物的报道一致，抗生素暴露以剂量依赖性方式显著降低存活率。100 μg/mL四环素暴露增加运动活性（尤其在光照期前6小时）而不影响蔗糖消耗，可能代表一种对四环素暴露的行为反应，但由于仅在光暗循环和最低浓度下评估，尚不能确定对内源性昼夜节律系统的影响。α多样性指数相对稳定而β多样性显著变化，表明抗生素选择性抑制核心细菌类群，同时允许机会性或耐受性类群扩张，可能破坏对宿主健康至关重要的微生物互作。Snodgrassella和Bartonella是受抗生素抑制最强烈的核心菌群，其次为Bifidobacterium和Gilliamella，这些菌群的耗竭可能损害与宿主免疫和代谢相关的菌群功能，导致抗生素暴露蜜蜂存活率降低。高浓度下Lactobacillus Firm4和Firm5的绝对丰度增加可能反映其对四环素的差异敏感性或竞争性细菌减少后的生态扩张，但不一定代表微生物稳态的恢复。免疫通路中Relish表达在头部和肠道均显著下调，表明该基因密切参与先天免疫应答的早期阶段，将微生物失调与免疫扰动联系起来。肠道中抗菌肽和抗氧化基因的下调可能削弱肠道免疫和抗氧化防御能力，增加对病原体攻击和氧化损伤的易感性。Snodgrassella丰度与Relish（头部）以及Apidaecin和CAT（肠道）表达的正相关提示该菌群与宿主免疫和抗氧化反应之间存在潜在关联，但这些相关性不能确立因果关系，因为四环素可能通过菌群依赖和非菌群依赖途径影响宿主基因表达。

研究结论：四环素暴露对工蜂产生不利影响，表现为存活率降低和运动活性改变。暴露还伴随肠道细菌群落结构的显著变化（包括多个核心细菌类群的变化），以及免疫和抗氧化相关基因表达的组织依赖性改变。Snodgrassella丰度与特定免疫和抗氧化转录本之间的正相关提示肠道细菌扰动与宿主生理稳态之间存在潜在联系，但这些关联不能确立肠道菌群的因果作用。未来需通过受控的微生物重建实验来确定特定肠道细菌是否介导宿主对四环素的反应。总体而言，该研究为蜜蜂对抗生素暴露的微生物和生理反应提供了整合视角。