家蚕双顺反子病毒（BmBDV）启动子区嵌入的新型转录本编码的自我调控性病毒小RNA促进病毒复制

《Insects》：A Self-Regulatory Viral Small RNA Embedded in the Promoter Region of a Novel Transcript Facilitates Bombyx mori Bidensovirus Replication

　　

家蚕双顺反子病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）是一种二分体单链DNA病毒，可导致蚕丝业严重损失，然而其转录复杂性及可能的自我调控性病毒小RNA尚未被探索。本研究对BmBDV感染的中肠组织进行了转录组和小RNA测序，以鉴定新的病毒转录本及功能性病毒衍生小RNA（virus-derived small RNAs，vsRNAs）。在VD1片段上发现了一个先前未被识别的转录本（转录本IV，nt 290–2929），其5′启动子区与NS2共享，3′多聚腺苷酸化信号与VP共享。值得注意的是，最丰富的病毒小RNA——一个命名为vsRNA-18895的20-nt小RNA（TPM高达11,750）——定位于NS1、NS2和转录本IV共有的启动子重叠区（VD1 nt 596–615）。体内agomir/antagomir实验表明，注射对应于vsRNA-18895的双链RNA（agomir）可显著上调NS1、NS2和转录本IV（分别达103.52倍、102.47倍和101.87倍），并增强VD1复制（103.26倍），而注射与vsRNA-18895互补的单链RNA（antagomir）则抑制这些过程；VD2及其他病毒基因（VP、PolB、NS3和P133）不受影响。由于antagomir注射后未直接测量vsRNA-18895本身的丰度，该处理可能降低或仅仅干扰了小RNA的活性。这些发现与一个正反馈回路一致，即一种嵌入新型转录本启动子区的病毒编码小RNA促进BmBDV复制，为无脊椎动物单链DNA病毒中自我调控性vsRNA提供了功能证据。由于同一基因座产生的互补反义小RNA丰度相当，因此不能排除该链对所观察效应的可能贡献。

研究背景与科学问题

家蚕（Bombyx mori）作为经济昆虫已有五千余年驯化历史，在亚洲多国具有重要的经济、文化和科研价值。然而，养蚕业持续受到病毒性疾病的威胁，包括家蚕双顺反子病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV；属于双顺反子病毒科Bidnaviridae）。BmBDV是家蚕幼虫传染性软化病的病原体，在中国被认为是危害最大的家蚕病原之一，受感染批次通常表现出幼虫萎缩、发育迟缓和高死亡率。BmBDV是一种无包膜二十面体病毒，衣壳包装两条线性单链DNA片段，即VD1（约6500 nt）和VD2（约6000 nt），两者均为有效感染所必需。VD1片段编码非结构蛋白NS1和NS2以及结构衣壳蛋白VP；VD2片段编码DNA聚合酶B（PolB）以及功能尚不明确的NS3和P133蛋白。此前通过RACE、Northern印迹和定量PCR等技术已建立了BmBDV的初步转录图谱，但转录本的完整性和相互间关系尚未完全解析，早期低分辨率分析可能遗漏了稀有或空间受限的异构体。

与此同时，来自不同界别的病毒在感染周期中会产生病毒编码的小RNA（virus-derived small RNAs，vsRNAs）。典型例子包括疱疹病毒的miRNA调节潜伏期和宿主免疫基因表达，以及从许多植物和动物RNA病毒产生的siRNA类vsRNA引导宿主RNAi机制靶向病毒转录本。在昆虫病毒组中，已在多种细小病毒（parvoviruses）、双顺反子病毒（dicistroviruses）和呼肠孤病毒（reoviruses）中报道了vsRNA，它们常定位到病毒基因组的离散热点区域，并在某些情况下已被证明调节病毒复制和宿主抗病毒防御。家蚕依赖强大的RNA干扰（RNAi）途径作为其主要抗病毒防御机制，实验破坏Dicer-2、Argonaute-2或相关组分可显著增加对BmNPV、BmCPV等几种家蚕病毒的易感性。因此，BmBDV感染很可能触发由宿主RNAi机器加工的vsRNA产生，且其中至少一部分vsRNA不仅仅是宿主防御的副产物，而是参与调节病毒基因表达。

基于上述背景，本研究旨在回答四个问题：（i）BmBDV转录图谱是否比以往认识更为复杂；（ii）BmBDV感染是否产生可系统分类的离散vsRNA群体；（iii）最丰富的vsRNA是否来源于特定基因组位点，特别是NS1和NS2的5′共享区；（iv）该vsRNA是否在体内对病毒基因表达和病毒复制发挥序列特异性调控效应。

研究方法概述

研究人员采用BmBDV易感家蚕品系‘Jingsong × Haoyue’的五龄幼虫进行口服接种感染，于接种后72小时（hpi）取中肠组织进行poly(A) RNA测序和小RNA测序（各三个生物学重复，测序由上海欧易医学科技公司完成）。通过STAR比对、StringTie从头组装和TransDecoder开放阅读框预测鉴定新型转录本，并用5′/3′ RACE验证转录本末端。小RNA文库经Illumina NovaSeq 6000平台测序后，用Bowtie将clean reads比对至BmBDV参考基因组鉴定vsRNA。体内功能实验采用化学合成的agomir（模拟vsRNA-18895的双链RNA）和antagomir（与vsRNA-18895互补的单链RNA），在接种后8小时经体腔注射入幼虫（每只2 μg），于注射后24、48、72和96小时取样检测病毒转录本（SYBR Green RT-qPCR）和病毒基因组拷贝数（qPCR）。

研究结果

3.1 BmBDV在五龄家蚕幼虫中肠建立稳健感染

通过qPCR定量显示，VD1和VD2拷贝数随时间依赖性增加，在72 hpi达到峰值，因此选择该时间点用于后续所有转录组和小RNA测序分析。

3.2 RNA-Seq鉴定出一个跨越VD1片段NS和VP位点的BmBDV新型转录本

poly(A) RNA测序（每个文库获得49.43–50.21百万条clean reads，Q30 > 93.96%）比对到BmBDV参考基因组的平均比例为98.52%。除了六种已知转录本外，还发现一个未注释的异构体，连续覆盖从NS1/NS2的5′区到VP的3′区，被命名为“转录本IV”（transcript IV）。5′ RACE和3′ RACE结合Sanger测序确定其转录起始位点（TSS）位于VD1第290位核苷酸，转录终止位点（TES）位于第2929位核苷酸。转录本IV的5′端位于NS1启动子的TATA盒内，与NS2的TSS位置相同；3′端与VP转录本共享典型的加尾信号（AAUAAA）。绝对RT-qPCR定量显示，转录本IV在所有时间点都是VD1衍生转录本中拷贝数最低的（24 hpi时为10^3.09拷贝/μL），但其丰度随时间逐渐增加。

3.3 病毒小RNA测序鉴定出一个位于NS1、NS2和转录本IV共享5′区的主导vsRNA

三个小RNA文库共获得22,048条病毒小RNA读段，长度分布强烈偏向20–25 nt（约占48%），其中超过45%恰好为20 nt。按TPM排序后，vsRNA-18895（20 nt，TPM = 11,750）是最丰富物种，精确映射到VD1第596–615位核苷酸，位于NS1、NS2和转录本IV的5′共享区内。其他三种高丰度vsRNA（vsRNA-14792、vsRNA-204和vsRNA-711）映射到相邻重叠位置，共有序列为5′-GAAAAGGCTGACGATCTCCT-3′。此外，另一个丰度较低的vsRNA簇映射到上游约200 nt处（VD1 nt 383–413），同样位于NS1/NS2/IV共享区。前六种最丰富vsRNA均映射到与NS1/NS2/IV相同的正义链，且其基因组坐标完全落在转录本IV内，支持转录本IV作为该主导簇的主要前体。

3.4 体内调控vsRNA-18895选择性调节NS1、NS2和转录本IV表达并影响BmBDV复制

与阴性对照（NC）相比，agomir处理在注射后24小时使NS1表达升高10^3.52倍、48小时升高10^2.75倍；antagomir处理则在24、48和72小时分别将NS1降至10^?1.87、10^?1.92和10^?2.21倍。NS2被agomir诱导24小时升高10^1.71倍、48小时升高10^2.47倍；antagomir使其降至10^?2.77、10^?2.16和10^?2.40倍。转录本IV被agomir诱导24小时升高10^1.87倍；antagomir使其在24和48小时降至10^?1.41和10^?0.94倍。相比之下，VP、PolB、NS3和P133在所有时间点基本不受影响。agomir处理使VD1拷贝数在24、48和72小时分别增加10^2.91、10^3.26和10^2.75倍；antagomir则在24–96小时持续降低VD1拷贝数至10^?1.57至10^?3.21倍。VD2仅在agomir处理后24小时出现短暂诱导（10^2.99倍），antagomir对其无显著影响。

讨论与结论

研究人员提出一个模型：BmBDV编码一个以NS1/NS2/转录本IV 5′共享区为核心的“病毒非结构RNA调控单元”。转录本IV跨越VD1的NS和VP位点（290–2929 nt），其5′共享区内存在以vsRNA-18895（TPM = 11,750，位于VD1 596–615位）为主导的vsRNA热点。体内实验表明，vsRNA-18895选择性上调含有其序列的三种转录本（NS1、NS2和IV），并通过此机制促进VD1基因组复制；antagomir介导的敲低则损害这些NS转录本的表达和VD1复制。这构成了一个“转录本→vsRNA→转录激活”的正反馈回路。

转录本IV的发现扩展了BmBDV转录图谱，展示了紧凑型单链DNA病毒如何通过重叠转录单元最大化有限编码容量。其低稳态丰度但随时间上升的表达模式，提示其主要功能可能是调控性而非翻译性。vsRNA-18895的正向调控方向不同于大多数已知病毒小RNA（如SV40和疱疹病毒的miRNA通常起抑制作用），可能通过小RNA介导的基因激活（RNAa）、miRNA样稳定mRNA或滴定宿主RNAi效应因子等机制实现。由于同一基因座也产生丰度相当的反义小RNA，目前无法排除反义链或Dicer加工的双链中间体的贡献。该发现的生物学意义在于：在同一个家蚕宿主中，其Dicer-2/Argonaute-2轴构成主要抗病毒屏障的同时，病毒编码的小RNA却促进自身基因表达和复制，表明BmBDV已劫持小RNA机器进行自我调控。

研究结论：BmBDV表达一个先前未注释的NS–VP跨域转录本（转录本IV），其与NS1和NS2的5′共享区含有一个主导的20-nt病毒衍生小RNA vsRNA-18895，以及一个丰度相当的互补反义物种。体内agomir/antagomir实验（调控该位点而非仅正义链分子）表明，该小RNA热点与NS1、NS2和转录本IV的表达以及VD1片段的复制功能偶联。这些数据与家蚕细小病毒中病毒编码小RNA介导的正反馈回路一致，同时指出正义链vsRNA-18895的特异性必需作用仍有待确立。这一“转录本→vsRNA→转录激活”模块将596–615位点确定为活跃BmBDV感染的候选标志物和基于RNA控制家蚕疾病的序列特异性靶点。