《Insects》：The Influence of Microbial Fermentation on Growth Performance, Protein Solubility, and Lipid Modulation in the Black Soldier Fly (Hermetia illucens) Larvae
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有机废弃物在全球范围内以日益加快的速度产生，迫切需要可持续的方法将有机残渣转化为高附加值生物产品。黑水虻幼虫（BSFL，Hermetia illucens）凭借其将有机废弃物转化为营养丰富生物质的能力，代表了废弃物资源化利用的有效生物技术解决方案。本研究评估了
有机废弃物在全球范围内以日益加快的速度产生，迫切需要可持续的方法将有机残渣转化为高附加值生物产品。黑水虻幼虫（BSFL，Hermetia illucens）凭借其将有机废弃物转化为营养丰富生物质的能力，代表了废弃物资源化利用的有效生物技术解决方案。本研究评估了果蔬废弃物与餐厨废弃物的微生物发酵对BSFL生长性能和营养组成的影响。研究人员使用产蛋白酶和产纤维素酶的细菌菌株对底物进行发酵，包括来自本实验室前期报道的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，S1）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，KSM12），以及来自微生物学研究组菌种保藏库的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，FM9）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，FM16）。研究设计了16个处理组，采用单一和混合细菌接种，以评估其对幼虫发育和营养同化的单独及联合效应。研究结果表明，与未发酵底物相比，底物发酵显著提高了幼虫质量、体长、存活率、生物转化效率（BCE）、摄入饲料转化效率（ECI）、饲料转化率（FCR）和废弃物减量指数（WRI）。BSFL的营养价值也得到提升，粗蛋白和脂质含量增加。蛋白质分级分析显示，可溶性蛋白（清蛋白和球蛋白）水平升高，醇溶蛋白和谷蛋白组分降低，表明蛋白质消化率提高。对选定组别的GC-MS脂质分析显示，中链脂肪酸（MCFAs）含量改善，尤其是月桂酸（C12:0）和棕榈酸（C16:0）。总体而言，BSFL底物的微生物发酵促进了有机废弃物的利用，验证了循环生物经济框架内可持续废弃物资源化利用的可行性，为家禽和水产养殖部门提供了营养丰富的饲料组分。
论文解读
一、研究背景与目的
全球人口增长导致有机废弃物产生量持续攀升，尤其发展中国家面临严峻的废弃物处理压力。以巴基斯坦为例，该国每日产生约87,000吨城市固体废弃物，年增长率约2.5%，其中大部分为有机废弃物。传统有机废弃物处理方式存在明显局限：蚯蚓堆肥受环境条件制约，生物转化效率低；厌氧消化则因需要高度受控条件、大规模管理复杂而缺乏商业应用可行性。在此背景下，黑水虻（Hermetia illucens）作为双翅目水虻科昆虫，被誉为快速发展的昆虫养殖产业中的“皇冠明珠”，其幼虫（BSFL）能够将有机废弃物高效转化为富含蛋白质和脂质的生物质，满足家禽、鱼类、猪及宠物等动物的膳食需求，同时可应用于生物柴油生产、几丁质生物聚合物制备、土壤堆肥和动物饲料等领域。
BSFL可在多种可分解有机废弃物底物上生长，包括餐厨废弃物、果蔬废弃物、酿造废料、烘焙废料、畜禽粪便、作物残渣及人类粪便等，生物降解效率可达55%–80%。然而，单一来源植物性废弃物的生物转化效率低于混合食物废弃物，这与高碳含量、半纤维素可及性有限及高木质素含量有关，导致幼虫蛋白质含量较低。通过改良底物条件和营养组成可优化BSFL生长，而底物预处理能增强高纤维、低蛋白底物的可消化性。
微生物发酵作为底物预处理策略日益受到关注。发酵过程中，复杂有机化合物被真菌、酵母和细菌酶解为简单化合物，淀粉和糖转化为醇和酸，蛋白质水解为氨基酸和肽。已有研究利用芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和酵母菌属（Saccharomyces）的单菌或复合菌株进行发酵转化。本研究旨在系统评估产蛋白酶和产纤维素酶细菌菌株——枯草芽孢杆菌（S1）、解淀粉芽孢杆菌（KSM12）、鼠李糖乳杆菌（FM9）和发酵乳杆菌（FM16）——单独及组合发酵对BSFL生长性能、生物转化效率参数、营养组成、脂质谱及蛋白质分级分布的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员从巴基斯坦伊斯兰堡NUST校园食堂和咖啡馆收集餐厨废弃物与果蔬废弃物（1:1），底物营养成分含蛋白质26.7%、脂肪19%、水分14%、纤维10%、碳水化合物30.3%。发酵菌株来源明确：枯草芽孢杆菌（S1）和解淀粉芽孢杆菌（KSM12）来自分子细胞生物工厂研究组，鼠李糖乳杆菌（FM9）和发酵乳杆菌（FM16）来自微生物学研究组，均保藏于NUST应用生物科学学院（ASAB）。实验采用2?因子设计将1 kg底物分为16个处理组（4株单菌、6组双菌组合、4组三菌组合、1组四菌组合及未发酵对照），在28°C、70%相对湿度条件下发酵8天，接种量为2%（v/w）。BSFL虫卵来自ASAB实验动物房昆虫饲养室，约100 g五日龄幼虫（平均个体重30–50 mg，约2000–2250只）接入各发酵箱培养7天，在1%预蛹出现时终止实验。主要分析手段包括：Kjeldahl法测定粗蛋白、索氏提取法测定粗脂质、改良Osborne分级法分离蛋白质组分、Bradford法定量蛋白质、GC-MS（QP2020，Shimadzu）进行脂肪酸甲酯（FAME）分析，数据采用GraphPad Prism 10.2.3进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。
三、研究结果
3.1 发酵动力学特征（温度和pH变化监测）
发酵为放热过程，微生物代谢有机质产生热量导致温度升高。单菌发酵温度从27°C升至29.5°C，双菌组合发酵升至31.5°C，混合接种显示更强烈的代谢协同效应。所有处理组pH值在发酵期间均下降，归因于芽孢杆菌和乳杆菌产生有机酸，随后趋于稳定或略有回升，表明系统内代谢稳定和缓冲效应。混合菌接种较单菌处理表现出更稳定和受控的酸化模式。
3.2 BSFL生长性能和生物量生产
发酵底物显著促进BSFL质量、体长和存活率。最高幼虫质量313 mg出现在S1F9和K12F9F16组，较未发酵对照组（173.25 mg）提高1.8倍。S1发酵组幼虫体长达27.5 mm，为对照（17.5 mm）的1.59倍。存活率方面，S1F9F16组（91%）和S1K12F9F16组（90%）最高，较对照分别提高1.69倍和1.67倍。7天饲养后整批幼虫重量从初始100 g增至243–546 g，S1F9F16组最高（546 g），对照最低（243 g）。
3.3 饲料转化率、生物转化效率、摄入饲料转化效率和废弃物减量指数
S1F9F16、S1K12F9F16和S1K12F9组的饲料转化率（FCR）显著较低（1.85和2.6），对照高达4.19，表明共发酵底物具有更优的饲料效率。生物转化效率（BCE）方面，S1F9F16和S1K12F16组较对照（14.3%）提高3.1倍至44%。废弃物减量指数（WRI）为11.5–13 g/day，S1K12和F9F16组最高（13 g/day），高于既往文献报道值。摄入饲料转化效率（ECI）以S1F9F16组最高（0.6%），为对照（0.2%）的2.25倍。
3.4 BSFL营养组成
发酵底物显著影响BSFL的生化组成。S1K12和S1F9组蛋白质含量最高（49.25%和47.31%），对照为36%。脂质含量以K12F9（29.4%）、K12F16（28.85%）和K12F9F16（26.4%）组最高，而含S1的处理组脂质含量（16.5–20.9%）低于对照（22.7%）。纤维含量方面，未发酵组最高（13.6%），发酵组降至5.3–11.5%，S1K12和S1K12F9F16组最低（5.3%）。灰分含量在发酵组中普遍降低（6–9.5%），非纤维碳水化合物（NFC）含量为13.77–30.3%，S1K12F16组最高。
3.5 BSFL可溶性蛋白质分级变化
Osborne分级法显示，发酵改变了BSFL蛋白质组分的分布。清蛋白含量11.2–22.0%（FM16组最高），球蛋白7.7–31.4%（F9F16和K12F16组最高），醇溶蛋白5.8–16.2%（KSM12组最高）。谷蛋白占主导（45.0–61.8%），未发酵组最高（61.8%），发酵后显著降低。含F9、F16和K12的共培养组表现出更高的可溶性蛋白和更低的谷蛋白，表明蛋白质消化率和品质提高。
3.6 GC-MS脂质谱分析
对脂质含量最高的K12F9、K12F16和K12F9F16组进行GC-MS分析，共鉴定出47种脂肪酸（C2:0–C30:0），涵盖饱和、单不饱和和多不饱和脂肪酸。未发酵组以棕榈酸（C16:0，6.29%）、肉豆蔻酸（C14:0，3.07%）、十五烷酸（C15:0，2.93%）和油酸（C18:1，7.97%）为主。K12F9组产生短链脂肪酸（SCFAs），包括丙酸（C3:0，0.56%）、戊二酸（C5:0，1.07%）和丁酸（C4:0，0.23%）。K12F16组中链脂肪酸（MCFAs）含量较高，月桂酸（C12:0）为主导（7.25%）。K12F9F16共发酵组脂质谱最为多样，月桂酸含量高达10.14%，同时含己酸（C6:0，0.70%）、庚酸（C7:0，1.23%）、硬脂酸（C18:0，0.36%）及少量长链多不饱和脂肪酸如二十二碳烯酸（C22:1，0.14%）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，混合发酵较单一培养表现出更强的温度动态变化，归因于协同底物转化和代谢强化。pH变化取决于菌群组成和相互作用：芽孢杆菌属初期降低pH后因碱性蛋白酶代谢活性而略有回升并趋于稳定；乳杆菌属通过产乳酸降低底物pH，芽孢杆菌随后通过利用酸性代谢物或产生碱性物质抑制酸化。BSFL存活率（54–91%）与既往使用发酵或混合有机底物的研究（>80%）相当。FCR结果与枯草芽孢杆菌发酵棕榈仁粕（1.91）、发酵废咖啡渣（1.6）及植物乳杆菌发酵南瓜（1.9）等研究一致。BCE显著高于文献报道的湿酒糟（13.9%）、废弃蘑菇底物（1.4%）、猪粪（4%）和城市废弃物（12%）等数值，归因于微生物发酵提高了底物可消化性。WRI（11.5–13 g/day）高于既往报道的庭院废弃物（4.4）、棕榈油废弃物（3.7）、食物废弃物（1.8）和鱼类废弃物（0.7）等数值。ECI最大值0.6高于快餐废弃物（0.4）等既往报道。蛋白质含量与既往研究一致，发酵通过分解复杂蛋白质和增加氨基酸可用性提高蛋白质消化率。脂质含量（19–29%）证实BSFL是优良脂质来源，可通过饲料组成调节，发酵可提高中链饱和脂肪酸（尤其是月桂酸）含量。纤维含量与既往研究一致，BSFL肠道缺乏木质素降解酶，发酵预处理可降低纤维抗性并最大化营养可利用性。灰分降低表明发酵消除了抗营养因子从而改善矿物质吸收。蛋白质分级变化反映底物营养价值及微生物发酵的影响，芽孢杆菌和乳杆菌将高分子量蛋白质消化为肽段，提高了氮利用效率和功能性；谷蛋白降低源于微生物蛋白酶对复杂结构蛋白的破坏，提高了消化率和营养价值。脂质谱分析表明，发酵底物改变了BSFL脂肪酸组成，微生物发酵可能改变了底物脂肪酸组成，BSFL脂肪酸谱受日粮脂质调节，反映脂肪酸的摄取和代谢修饰，协同作用提高了饱和及不饱和脂肪酸水平，形成了更平衡的功能性脂质谱。
研究结论表明，微生物发酵有机废弃物可改善BSFL的生长、养分利用和生化组成。产蛋白酶和产纤维素酶菌株提高了底物可消化性、幼虫生物量、饲料转化率、废弃物减量指数和存活率。Kjeldahl和Osborne分级法验证了蛋白质向更可溶性组分（更多清蛋白和球蛋白，更少醇溶蛋白和谷蛋白）的重新分布，即蛋白质消化率提高。GC-MS脂质谱分析显示中链脂肪酸（尤其是月桂酸和棕榈酸）含量提高，这些脂肪酸具有抗菌和能量功能。这归因于微生物水解增强营养物生物可利用性。总体而言，基于发酵的策略将低价值废弃物可持续地转化为营养丰富的BSFL生物质，为循环生物经济作出贡献，并最大限度减少环境足迹。
