PP2A依赖性的GABAB受体下调调节了生长抑素中间神经元的功能和可塑性

《iScience》：PP2A-dependent downregulation of GABAB receptors modulates somatostatin interneurons function and plasticity

　　亮点
• GABAB受体激活导致其自身从生长抑素神经元膜上丢失
• 长时程增强通过钙通道丢失而受损
• 抑制蛋白磷酸酶2A可阻止受体和通道丢失
• GABAB受体激活导致回路水平可塑性的长期改变

摘要
皮层回路需要精确的抑制性和兴奋性神经传递来编码信息并防止病理状态。代谢型GABAB受体（GABABRs）是哺乳动物神经元中关键的抑制性调节因子。在GABA能中间神经元（INs）中，GABABR激活减少抑制作用，从而引发去抑制机制。海马生长抑素表达（SST）中间神经元对主细胞（PCs）的远端树突和其他中间神经元提供反馈抑制。SST中间神经元的可塑性已被证实可控制依赖代谢型谷氨酸受体（mGluRs）和GABABRs的海马回路功能。GABABRs是否在更长时间尺度上调节SST中间神经元的功能，以及这是否影响回路功能，仍不清楚。
我们结合定量冷冻断裂复型免疫电子显微镜、离体电生理学和药理学方法，证明GABABR激活通过蛋白磷酸酶2A（PP2A）依赖性细胞表面GABABR、mGluR1α受体和Cav1.2（L型）Ca2+通道的丢失，调节SST中间神经元的长时程增强（LTP）。SST中间神经元中GABABR的丢失使海马活动转向对CA1长程输入更大的可塑性。

图形摘要

引言
皮层微回路的适当功能依赖于动态平衡的兴奋性和抑制性突触传递，这维持了神经编码并有助于记忆形成。这些回路如何响应活动水平的变化或持续的药理活性，对于理解大脑在静息状态下如何工作以及神经病理状态如何导致行为和认知改变至关重要。
突触抑制在很大程度上由局部中间神经元（INs）的异质群体产生。这些中间神经元从其突触前末梢释放GABA，激活兴奋性主细胞和中间神经元上的突触和突触外离子型GABAA受体（GABAARs）以及代谢型GABAB受体（GABABRs）。这种对中间神经元的抑制会降低其活性，导致局部GABA释放减少，从而降低抑制控制——称为去抑制。抑制和去抑制之间的动态相互作用对于确保神经元活动的时间和强度以产生复杂行为至关重要。迄今为止，大多数研究的去抑制形式集中在直接突触GABAAR介导的效应上，这些效应可以调节海马和新皮层的回路水平可塑性。虽然我们和其他人已经很好地描述了GABABR信号对中间神经元的直接影响，但其激活如何塑造抑制性细胞的长期兴奋性并影响回路活动仍然不太清楚。
在海马CA1区，一种主要的中间神经元类型是表达神经肽生长抑素（SST）的中间神经元，其胞体树突域位于始层/白质（str. O/A），接收来自局部主细胞的输入，其轴突在腔隙分子层（Str. L-M）分支。因此，SST中间神经元对CA1回路提供强大的反馈抑制，导致复杂的回路控制。首先，它们直接抑制CA1主细胞的远端树突，与内嗅皮层输入共终止，强烈抑制空间信息。其次，SST中间神经元去抑制近端树突域，从而门控来自CA3的情境输入。因此，CA1主细胞输入到SST中间神经元的联合型长时程增强（LTP）导致海马信息传递的功能性重排，有利于CA3输入，并可能在行为相关时间尺度上改变海马的回路动力学。我们之前已经证明，GABABRs通过直接抑制含Cav1.2的L型电压门控Ca2+通道（VGCCs），急性抑制局部CA1主细胞到SST中间神经元树突（在str. O/A）的LTP诱导。除了对LTP诱导的这些影响外，GABABRs还强烈调节SST中间神经元在来自CA1主细胞的突触输入和向其输出的局部回路整合。鉴于GABA对GABABRs的高亲和力及其众多辅助蛋白，它们经历快速脱敏和激动剂依赖性内化加速。此外，已知GABABRs与代谢型谷氨酸受体（mGluRs）相互作用，优先与1α型受体（mGluR1α）相互作用，如在小脑中所显示。考虑到SST中间神经元上mGluR1α和GABABRs的高密度，这些细胞中也存在受体串扰是合理的。GABABR信号是否易受SST中间神经元细胞表面受体快速丢失的影响，以及这是否影响细胞功能和局部回路，仍然未知。
我们假设GABABR激活调节其自身表面表达，有利于SST中间神经元更大的可塑性。为了确定这一点，我们进行了定量SDS消化冷冻断裂复型免疫金标记（SDS-FRL）电子显微镜、选择性GABABR激动剂巴氯芬长期应用后小鼠海马CA1的离体电生理记录以及行为表征。我们发现，与我们的假设相反，在持续GABABR激活后，SST中间神经元的突触可塑性降低，这与直接受体激活无关。这种可塑性降低是由于伴随的蛋白磷酸酶2A（PP2A）依赖性GABABRs、Cav1.2 VGCCs和mGluR1α的减少——所有这些都是SST中间神经元LTP所必需的。最后，我们表明巴氯芬给药导致CA1长程输入的回路水平增强，这依赖于SST中间神经元的可塑性。

结果
在本研究中，我们测试了持续巴氯芬应用诱导GABABRs激活导致受体表面表达下调，从而有利于SST中间神经元增强可塑性的假设。为了研究这一机制，我们在成年小鼠中进行了定量免疫电子显微镜（iEM）和电生理学。

巴氯芬预应用后，SST膜中天然GABABRs、mGluR1α和L型钙通道下调
我们之前已经表明，小鼠SST中间神经元树突具有高密度的GABAB1、CaV1.2和mGluR1α。后两种蛋白是SST中间神经元联合型theta脉冲刺激（aTBS）LTP所必需的，并被GABABRs抑制。为了确定GABABR激动剂巴氯芬（20 μM）预应用是否改变GABABRs与mGluR1α和CaV1.2相比的膜定位，我们对用巴氯芬预处理的急性小鼠海马切片（n = 5只小鼠）进行了SDS-FRL iEM分析，并与用溶媒处理（n = 5只小鼠）或GABABR拮抗剂CGP-55,845（5 μM，n = 4只小鼠；图1A）处理的切片进行比较。所有SDS-FRL数据显示为动物平均值，统计基于线性混合效应模型以考虑动物间变异性。每只动物内每个树突轮廓的数据显示在图S1中。

图1 持续的GABABR激活导致推测的SST中间神经元膜相关GABAB1、CaV1.2和mGluR1α蛋白减少
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(A) 实验概览示意图，指示处理时间和实验样本时间。
(B) 溶媒切片中CA1 str. O/A区推测的SST中间神经元树突上mGluR1α（15 nm免疫金颗粒）、CaV1.2（10 nm，蓝色叠加）和GABAB1（5 nm，红色叠加）的SDS-FRL电子显微镜示例图。在巴氯芬预应用（20 μM）20分钟的脑切片中相同的标记，（C）或CGP-55,845（5 μM），（D）。
(E) GABAB1（左，对照：54个树突，5只小鼠；巴氯芬：78个树突，5只小鼠；CGP：74个树突，4只小鼠）、Cav1.2（中，对照：68个树突，5只小鼠；巴氯芬：78个树突，5只小鼠；CGP：74个树突，4只小鼠）和mGluR1α（右，对照：77个树突，5只小鼠；巴氯芬：78个树突，5只小鼠；CGP：74个树突，4只小鼠）的标记密度定量，在溶媒处理（Ctrl.，黑色）、巴氯芬预应用（Bacl.）或CGP-55,845（CGP）处理的切片中。
所有数据显示为箱线图，描绘25%–75%范围及中位数、最大范围，以及来自每只小鼠的数据以空心圆叠加显示。统计显示：ns，不显著；p > 0.05，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001；均来自LMM分析后的事后Tukey检验。所有图像的比例尺代表200 nm。

在对照条件下（图1B），推测的SST中间神经元树突基于高水平的mGluR1α表面标记被识别，平均密度为37.8 ± 4.8颗粒/μm2（图1B和E）。与我们之前在老鼠中的数据一致，mGluR1α阳性树突显示出高密度GABAB1亚基标记，为34.8 ± 2.9颗粒/μm2，以及L型通道亚基CaV1.2的中等表达，为5.43 ± 0.98颗粒/μm2（图1B和1E）。与对照切片相比，巴氯芬预应用导致GABAB1密度降低46%，至18.8 ± 2.6颗粒/μm2（t(5,5) = 3.52，p = 0.014，Tukey检验；图1C和1E）。我们观察到CaV1.2降低56%，至2.38 ± 0.29颗粒/μm2（t(5,5) = 5.77，p = 0.001，Tukey检验），mGluR1α标记降低65%，至13.3 ± 2.1颗粒/μm2（t(5,5) = 4.82，p = 0.002，Tukey检验）（图1C和1E）。应用GABABR拮抗剂CGP-55,845并未降低GABAB1（t(5,4) = 0.69，p = 0.77，Tukey检验）、CaV1.2（t(5,4) = 1.69，p = 0.27，Tukey检验）或mGluR1α（t(5,4) = 0.84，p = 0.69，Tukey检验）的密度相对于对照水平（图1D和1E）。这种对效应通道的影响似乎仅限于SST中间神经元，因为在同一复型中测量CA1主细胞树突显示，虽然巴氯芬预应用使GABAB1密度降低49.9%（F(5,5) = 45.22，p = 4.57 × 10?10，线性混合效应模型（LMM，图S2）），但CaV1.2未改变（F(3,3) = 0.009，p = 0.93，LMM；图S2）。mGluR1α未测试，因为该蛋白在CA1主细胞上不大量表达。总之，这些数据表明GABABR激活导致其自身从SST中间神经元膜上减少，但也导致CaV1.2和mGluR1α密度下调。

巴氯芬预应用导致SST中间神经元中Cav1.2和1组mGluR介导的电流减少
为了确定巴氯芬预应用是否调节SST中间神经元中Cav1.2和mGluR1α的功能，我们接下来使用靶向药理学对鉴定出的细胞进行全细胞膜片钳记录，以探究受体和通道丢失（图2A），并确定这是否依赖于PP2A。

图2 巴氯芬预应用后CaV1.2和1组mGluR介导的电流减少
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(A) 记录条件示意图，指示处理周期和记录时间。
(B) 在SST中间神经元中从?60 mV去极化刺激后记录到的尼非地平敏感性VGCC电流响应示例。虚线表示用于比较的对照响应幅度。
(C) 对照（黑色，16个细胞）和巴氯芬预应用（11个细胞）中尼非地平敏感性VGCC电流的电压依赖性（左）和峰值尼非地平敏感性电流（右）定量。
(D) 在预应用1 μM冈田酸的SST中间神经元中，尼非地平减去的分离VGCC电流响应示例。
(E) 在OA预应用SST中间神经元中尼非地平敏感性VGCC电流的电压依赖性（左）和峰值尼非地平敏感性电流（右）定量；对照（黑色，5个细胞）和巴氯芬预应用（5个细胞）。
(F) 在对照条件（黑色）或巴氯芬预应用（红色）下，在溶媒或1 μM OA预应用后，向SST中间神经元喷注50 μM S-DHPG后的电压响应示例。
(G) S-DHPG喷注后绝对电流幅度定量。数据来自溶媒：对照（黑色，8个细胞）和巴氯芬预应用（6个细胞）；以及OA处理：对照（黑色，6个细胞）和巴氯芬预应用（6个细胞）。
(H) S-DHPG喷注诱导瞬变的曲线下面积（AUC）定量。数据来自溶媒：对照（黑色，8个细胞）和巴氯芬预应用（6个细胞）；以及OA处理：对照（黑色，6个细胞）和巴氯芬预应用（6个细胞）。所有数据显示为平均 ± SEM（电流-电压图）或箱线图显示25%–75%箱体及中位数，并显示最大范围。单个细胞数据叠加显示。统计显示：ns，不显著；p > 0.05，?p < 0.05；来自双向ANOVA和Mann-Whitney非参数检验。

由于含Cav1.2的VGCC是SST中间神经元中GABABR介导抑制的主要靶点，我们首先使用含Cs-葡萄糖酸内液并含有QX-314（5 mM）的全细胞记录，分别阻断电压激活的K+和Na+通道，在存在CNQX（10 μM）、DL-AP5（50 μM）和gabazine（10 μM）以阻断离子型受体信号的情况下。高电压激活Ca2+响应从?60 mV电压钳测量，施加5 mV去极化电流步进，然后浴应用选择性L型VGCC阻断剂尼非地平（10 μM；图2B）。在去极化刺激范围内测得的平均减除L型电流显示，在对照条件下记录的SST中间神经元中有大振幅电流，而在巴氯芬预应用的切片中这些电流显著减少，但电压依赖性相似。我们发现巴氯芬预应用使峰值L型电流降低37%（U(16,11) = 50；p = 0.032，Mann-Whitney检验，图2C）。我们进行了相同的记录，但在孵育了PP2A抑制剂冈田酸（OA，1 μM；图2D）的切片中。阻断PP2A活性对预先应用巴氯芬后的电流-电压反应或L型钙电流峰值几乎没有影响（U(5,5) = 0；p = 0.008，Mann-Whitney检验；图2E）。对于mGluR1信号通路，我们以全细胞构型记录SST中间神经元，然后在细胞体附近100–200微米范围内喷施选择性、高亲和力的I组mGluR激动剂S-二羟苯甘氨酸（DHPG；50 μM，200毫秒，10 PSI）。S-DHPG喷施在SST中间神经元中引起了大幅且缓慢的去极化电流，这些电流对mGluR1α选择性拮抗剂LY367,385（100 μM）部分敏感。在预先应用巴氯芬的切片中测量相同的S-DHPG诱导电流时，通常观察到较小的电流（图2F）。对S-DHPG峰值电流的定量分析显示，预先应用巴氯芬降低了振幅（F(1,22) = 7.99，p = 0.01，双因素方差分析[交互作用]，图2G）和电荷转移（F(1,22) = 9.59，p = 0.005，双因素方差分析[交互作用]，图2H）效应，这些效应在切片于巴氯芬预应用前与OA孵育时不存在。巴氯芬预应用依赖的Cav1.2和mGluR1α表面密度降低由PP2A介导。为确认SST中间神经元中GABAB受体的表面下调确实依赖于PP2A，我们使用了一种在SST启动子下表达与黄色荧光蛋白融合的视紫红质通道蛋白-2（ChR2/YFP）的小鼠系，从而能够在SDS-FRL iEM中选择性识别SST中间神经元的树突。最初，我们制备了用PP2A抑制剂OA处理的野生型小鼠切片。然而，在这些切片中，我们在推定的SST中间神经元和CA1锥体细胞树突轮廓中观察到对mGluR1α、GABAB1或CaV1.2的标记极少或没有（图S3）。这一效应在超过5次独立实验中均观察到。因此，我们接下来使用小分子PP2A抑制剂fostriecin（50 nM），在巴氯芬预应用前将切片孵育1小时（图3A）。在来自ChR2/YFP小鼠的str. O/A中，我们观察到YFP的强免疫标记（33.7 ± 1.07颗粒/μm2，图3B）。在载体处理的切片中，巴氯芬预处理后GABAB1表面密度降低了51%（17.7 ± 4.5颗粒/μm2，t(3,3) = 3.9，p = 0.012，Kenward-Roger检验，图3B和3D），与mGluR1α标记树突的观察结果一致（图1）。与fostriecin孵育可阻止巴氯芬预处理介导的GABAB1表面密度降低（32.0 ± 1.7颗粒/μm2，t(3,3) = 0.47，p = 0.66，Kenward-Roger检验，图3C和3D），证实了PP2A抑制可防止GABAB受体表面下调。

图3 PP2A的抑制阻止了SST中间神经元激活后表面GABAB受体表达的降低
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(A) 实验条件示意图，突出显示处理周期和固定时间。(B) 在CA1的str. O/A中，对SST-cre依赖的ChR2/YFP表达（18 nm免疫颗粒）和GABAB1（6 nm，红色叠加）进行SDS-FRL的示例电子显微照片，切片为载体或巴氯芬预应用（20 μM）处理。(C) 相同标记，但在巴氯芬预应用前用50 nM fostriecin孵育1小时的切片中进行。(D) 在有或无fostriecin孵育的情况下，对载体处理切片（Ctrl.，黑色，79个树突[载体]，70个树突[fostriecin]，各3只小鼠）或巴氯芬预应用切片（Bacl.，红色，87个树突[载体]，81个树突[fostriecin]，各3只小鼠）中的GABAB1密度进行定量。所有数据显示为小提琴图和箱线图，描绘25%–75%范围，显示中位数、最大范围，以及从个体树突或小鼠计算的平均密度，以空心圆叠加。比例尺代表200 nm。

为确定GABAB受体依赖的L型电压门控钙通道（VGCC）缺失是否也需要PP2A依赖机制，我们进行了相同的实验，但标记CaV1.2（图4A）。在载体处理切片的复制品中，我们观察到CaV1.2标记为3.75 ± 0.40颗粒/μm2，在巴氯芬预应用切片中降低了45%（2.07 ± 0.24颗粒/μm2，t(3,3) = 3.51，p = 0.010，Kenward-Roger检验，图4B和4D），与mGluR1α免疫标记实验一致（图1）。fostriecin预孵育（图4C）阻止了巴氯芬处理后CaV1.2表达的降低（3.74 ± 0.24颗粒/μm2，t(3,3) = 0.88，p = 0.41，Kenward-Roger检验，图4C和4D），证实PP2A抑制可阻止质膜定位的Cav1.2通道的移除。

图4 PP2A的抑制阻止了GABAB受体激活后SST中间神经元膜上CaV1.2的下调
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(A) 实验条件示意图，突出显示处理周期和固定时间。(B) 在CA1的str. O/A中，对SST-cre依赖的ChR2/YFP表达（18 nm免疫颗粒）和CaV1.2（6 nm，蓝色叠加）进行SDS-FRL的示例电子显微照片，切片为载体或巴氯芬（20 μM）处理。(C) 相同标记，但在巴氯芬应用前用50 nM fostriecin预孵育1小时的切片中进行。(D) 在有或无fostriecin预应用的情况下，对载体处理切片（Ctrl.，黑色，74个树突[载体]，69个树突[fostriecin]，各3只小鼠）或巴氯芬处理切片（Bacl.，红色，86个树突[载体]，86个树突[fostriecin]，各3只小鼠）中的CaV1.2密度进行定量。所有数据显示为小提琴图和箱线图，描绘25%–75%范围，显示中位数、最大范围，以及从个体树突或小鼠计算的平均密度，以空心圆叠加。比例尺代表200 nm。

这些数据证实，巴氯芬诱导的GABAB受体表面表达降低在str. O/A的SST中间神经元中需要PP2A，并且抑制这一点可阻止CaV1.2从其树突膜上丢失。

持续的GABAB受体激活导致SST中间神经元的可塑性降低，这种可塑性由受体丢失介导。我们之前已经证明，急性激活GABAB受体可以阻止SST中间神经元中aTBS诱导的LTP。然而，我们的数据表明，应用巴氯芬会导致SST中间神经元的LTP机制减少。为确定GABAB受体的持续激活是否塑造SST中间神经元的长期可塑性景观，我们首先在囊泡GABA转运体（vGAT）启动子下表达YFP（Venus变体）的成年雄性和雌性转基因小鼠的str. O/A中进行全细胞膜片钳记录（图5A）。我们在本研究中记录了108个str. O/A中间神经元，其中成功恢复的（n = 70）通常具有局限于str. oriens（str. ori）的水平树突，轴突投射至str. L-M，并且均匀地呈SST免疫反应阳性（图5B）。记录的SST中间神经元显示出明显的Ih介导的电压降，并具有中到高频的动作电位（AP）发放，在巴氯芬预应用后降低（图5C），这是由于输入阻抗降低和基强度升高所致（表S1）。

图5 长时间巴氯芬应用消除了SST中间神经元局部输入的LTP
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(A) 记录条件示意图，突出显示处理周期和记录时间。(B) 从成年小鼠CA1区域str. O/A记录的SST中间神经元的示例重建，显示胞体和树突（黑色）以及轴突（红色）分支。插图显示SST（绿色）和生物胞素（紫色）的免疫反应性。比例尺显示为100 μm。(C) 从载体（黑色，10个细胞）和巴氯芬预应用（Bacl.pre-app；红色，5个细胞）条件下记录的SST中间神经元对超极化至去极化电流阶跃（?500至+500 pA，100 pA步进，500毫秒持续）的电压反应。右侧，两种条件下记录的SST中间神经元动作电位输出的定量。(D) 载体（上，黑色）和20 μM巴氯芬预应用（下，红色）条件下测量的兴奋性突触后电流（EPSC）示例轨迹，在对照条件下；对于aTBS-LTP轨迹，基线EPSC显示在底层（灰色和粉色）。中间，载体（黑色）和巴氯芬预应用（红色）在aTBS-LTP诱导前后EPSC振幅的时间进程图；显示100%基线水平（灰色虚线）。右侧，aTBS-LTP后（25–30分钟）与基线相比EPSC振幅变化的条形图，载体（黑色，11个细胞）和巴氯芬预应用（红色，8个细胞）；显示100%基线水平（灰色虚线）。(E) 在5 μM CGP-55,845（CGP）存在下，根据与(D)相同的方案进行SST中间神经元的aTBS-LTP记录，但来自6个细胞（对照）和6个细胞（巴氯芬）。(F) 切片预先应用1 μM冈田酸1小时，随后进行载体或巴氯芬预应用的aTBS-LTP，来自7个细胞（对照）和5个细胞（巴氯芬）。(G) 在载体或巴氯芬预应用前用50 nM fostriecin预孵育1小时的切片中的aTBS-LTP，来自5个细胞（对照）和7个细胞（巴氯芬）。所有数据显示为平均值±SEM（时间进程图）或箱线图，显示25%–75%范围，显示中位数、最大范围以及个体细胞结果。统计显示为：ns，不显著；p > 0.05，?p < 0.05，??p < 0.01（Mann-Whitney非参数检验）。

在载体对照条件下，我们观察到由穹窿刺激引起的兴奋性突触后电流（EPSC），振幅为197.8 ± 17.6 pA（刺激强度13.3 ± 3.9 V，n = 11个SST中间神经元），在aTBS-LTP诱导后，其促进作用达到基线水平以上68.5% ± 12.9%（p = 0.001，Wilcoxon符号秩检验）。在巴氯芬预应用切片中，我们观察到基线EPSC平均振幅为195.6 ± 54.6 pA（刺激强度8.5 ± 2.9 V，n = 8个SST中间神经元），与载体记录在振幅（U(11, 8) = 28，p = 0.21，Mann-Whitney检验）或刺激强度（U(11, 8) = 33，p = 0.38，Mann-Whitney检验）上没有差异。在巴氯芬预应用切片中诱导aTBS-LTP未能将EPSC振幅增加到基线水平以上（基线以上11.3% ± 9.6%，p = 0.38，Wilcoxon符号秩检验），且低于载体条件（U(11,8) = 10；p = 0.004，Mann-Whitney检验）。为确认aTBS-LTP的丧失不是由于GABAB受体的直接激活，我们进行了相同的实验，但在基线记录和LTP诱导及维持期间应用GABAB受体拮抗剂CGP-55,845（CGP，5 μM）（图5E）。在CGP存在下，我们仍然无法在巴氯芬预应用切片中诱导aTBS-LTP（基线以下31.3% ± 19.6%，p = 0.31，Wilcoxon符号秩检验），尽管在载体处理切片中持续诱导（基线以上54.5% ± 28.0%，p = 0.031，Wilcoxon符号秩检验；U(6,6) = 5；p = 0.041，Mann-Whitney检验），证实aTBS-LTP抑制不是由于直接受体激活。有趣的是，我们发现在CGP存在下诱导的SST中间神经元LTP与对照相比没有差异（U(11,6) = 23；p = 0.35，Mann-Whitney检验），表明在基线条件下GABAB受体对LTP诱导的控制最小。

突触后GABAB受体经历PP2A依赖的内化控制。我们接下来询问SST中间神经元中受损的aTBS-LTP是否由于PP2A依赖机制。在这些实验中，我们在载体或巴氯芬预应用前将切片与OA（1 μM）孵育60–120分钟。在OA孵育后，我们继续在载体切片（基线以上112.1% ± 26.4%，p = 0.016，Wilcoxon配对检验）和巴氯芬预应用切片（基线以上140.1% ± 31.3%，p = 0.029，Wilcoxon配对检验）的SST中间神经元中观察到可靠的aTBS-LTP，两者没有差异（U(7,5) = 15；p = 0.76，Mann-Whitney检验；图5F）。由于我们的SDS-FRL标记在OA处理下不可行（图3），我们接下来确认fostriecin（50 nM）产生的效果与OA相似。在fostriecin孵育（60–90分钟）后，我们在载体切片中观察到aTBS-LTP的趋势（基线以上81.8% ± 45.6%，p = 0.063，Wilcoxon配对检验），在巴氯芬预应用切片中观察到强烈的LTP（基线以上69.0% ± 17.0%，p = 0.016，Wilcoxon配对检验），与载体没有差异（U(5,7) = 16，p = 0.876，Mann-Whitney检验；图5G）。

综合这些数据表明，持续的GABAB受体激活损害了CA1锥体细胞输入到SST中间神经元的aTBS-LTP诱导，这可能独立于LTP诱导期间的受体激活，并且可能依赖于PP2A依赖的膜锚定CaV1.2和mGluR1α下调。

GABAB受体的长时间激活损害了GABA的突触前释放，但未影响CA1锥体细胞中GABAB受体的突触后表达。评估持续药理激活后GABAB受体信号的更广泛功能对于推断全回路效应至关重要。在CA1锥体细胞中，巴氯芬预应用后，我们观察到GABAB1有降低趋势，但CaV1.2表面表达不变。我们接下来确定这些效应是否改变了对CA1锥体细胞以及在其上的抑制性信号传导。因此，我们在CNQX（10 μM）、DL-AP5（50 μM）和gabazine（10 μM）存在下记录GABAB受体介导的慢抑制性突触后电流（IPSC），以阻断离子型受体信号（图6A）。我们发现，巴氯芬预应用后慢IPSC显著降低（U(10,7) = 3，p = 0.0007，Mann-Whitney检验；图6B）。然而，巴氯芬介导的全细胞电流（IWC）不受巴氯芬预应用影响（图6C），峰值电流密度正常（U(9,7) = 15.5，p = 0.10，Mann-Whitney检验；图6D）。对这种突触和药理激活GABAB受体之间脱节的一种解释可能是GABA释放受损。因此，我们测量了str. 刺激后离子型GABAAR介导的IPSC的输入/输出（I/O）关系。L-M刺激作为突触强度的替代指标。我们发现，对于相同的刺激，快IPSC的振幅始终较低，量化后显示I/O斜率降低了46%（U(7,6) = 4，p = 0.014，Mann-Whitney检验，图6E）。这种GABA强度的丧失可能源于突触前释放受损，因为在巴氯芬预应用组中，配对脉冲比率（PPR）显著升高（U(7,6) = 1，p = 0.0023，Mann-Whitney检验，图6F）。为了确定巴氯芬预应用是否改变突触前GABABR功能，我们接下来将10 μM巴氯芬浴应用于快IPSC记录中（图6G）。预应用巴氯芬的切片在str. L-M中倾向于具有较低的GABABR突触前抑制IPSC作用（U(7,6) = 7，p = 0.051，Mann-Whitney检验，图6H）。最后，我们比较了巴氯芬预应用对CA1 PC内在兴奋性的影响。与我们在SST IN中观察到的相反，我们发现CA1 PC在很大程度上不受巴氯芬预应用的影响，仅观察到膜电容和动作电位动力学的细微变化（表S2）。图6 延长GABABR激活会降低str. L-M中的GABA释放，特异性作用于突触前而非突触后GABABR介导的抑制显示完整图注图查看器(A) CA1 PC记录实验示意图及在CNQX（10 μM）、DL-AP5（50 μM）和gabazine（10 μM）存在下，从?65 mV电压钳制记录str. L-M经5×200 Hz刺激后的慢IPSC示例，来自对照切片（黑色）和预应用20 μM巴氯芬的切片（红色）。(B) 对照和巴氯芬预应用切片中慢抑制性突触后电流（IPSC）振幅的量化，来自10个细胞（对照）和7个细胞（巴氯芬预应用）。(C) 在对照和巴氯芬预应用切片中，浴应用10 μM巴氯芬后，从?65 mV记录的全细胞电流（IWC）的时间过程。量化IWC电流密度，标准化为细胞电容，来自9个细胞（对照）和7个细胞（巴氯芬预应用）。(D) 在CNQX（10 μM）、DL-AP5（50 μM）存在下，使用Cs-葡萄糖酸内溶液，从0 mV进行str. L-M配对刺激诱发的快IPSC，来自对照和巴氯芬预应用切片。浴应用10 μM巴氯芬后记录的轨迹显示在下方（灰色/粉色）。右侧，两组快IPSC振幅的输入-输出（I/O）图。右侧，快IPSC的I/O斜率量化。数据来自7个细胞（对照）和6个细胞（巴氯芬预应用）。(E) 处理组之间配对脉冲比率（PPR）的比较。数据来自7个细胞（对照）和6个细胞（巴氯芬预应用）。(F) 在对照和巴氯芬预应用切片中，浴应用10 μM巴氯芬和5 μM CGP-55,845（CGP）前后，快IPSC振幅的时间过程。(G) 巴氯芬介导的快IPSC振幅抑制的量化，表示为基线百分比。数据来自7个细胞（对照）和6个细胞（巴氯芬预应用）。数据显示为均值±SEM（C、E和G）或箱线图，显示25%–75%箱体和中位数，最大范围（B、D、F和H）。单个细胞数据显示为叠加。统计显示为：ns，不显著；p > 0.05，?p < 0.05，???p < 0.001；来自Mann-Whitney非参数检验。这些数据共同表明，延长GABABR激活对CA1 PC的突触后功能影响有限；特别是，我们没有发现功能性GABABR表达减少的证据。然而，由于突触前GABA释放的强烈减少，突触后IPSC在功能上降低。GABABR依赖性SST IN中LTP蛋白的缺失导致CA1 PC的颞叶传入可塑性增强SST IN已知控制CA1 PC发生可塑性的能力，特别是在其远端树突中，与内嗅皮层输入对齐的str. L-M。为了确定延长GABABR激活及随后的SST IN可塑性丧失是否改变颞叶LTP，我们在CA1的str. L-M进行了细胞外场记录，通过重复刺激alveus诱导SST IN的可塑性，随后对颞叶通路进行高频刺激（HFS，1×100 Hz），在载体或预应用20 μM巴氯芬20分钟的切片中进行（图7A）。在str. L-M HFS后，我们观察到两组所有记录中的场兴奋性突触后电位（fEPSP）振幅均增加（图7B），在诱导后50–60分钟测量时，载体对照记录中比基线高25.6% ± 7.8%，而巴氯芬预应用切片中没有差异（20.5% ± 10.4%；U(15,19) = 104，p = 0.19，Mann-Whitney检验，图7C）。然而，我们注意到，与载体对照相比，预应用巴氯芬的切片中未能发生LTP（高于基线>10%）的比例更高（χ2 = 7.5，p = 0.0062卡方检验；图7D）。因此，我们接下来只分析观察到LTP的记录（图7E）。对成功LTP记录的进一步量化（图7F）显示，巴氯芬预应用切片中的强直后增强（HFS后0–1分钟）高出34%（U(11,10) = 25，p = 0.018，Mann-Whitney检验），在20–30分钟测量的fEPSP（与全细胞记录一致）也比对照切片高出24%（U(12,10) = 27，p = 0.015，Mann-Whitney检验），而50–60分钟测量的LTP较高，但未达显著水平（U(12,10) = 37，p = 0.07，Mann-Whitney检验）。我们观察到对照和巴氯芬预应用切片之间的fEPSP斜率相对于刺激强度没有差异（图7G）。这些效应可能特异于SST IN，因为在mGluR1α特异性拮抗剂LY367,385（100 μM）存在下进行相同的记录，阻止了巴氯芬预应用对颞叶LTP的任何影响（图S4）。这也排除了巴氯芬预应用对GABA能释放和CA1 PC兴奋性的影响作为该效应的原因。此外，情境恐惧条件反射是一种需要SST IN可塑性的学习范式，在条件反射前1小时给予巴氯芬时受损（图S5）。图7 先前GABABR激活消除SST IN对短期颞叶（TA）LTP的抑制显示完整图注图查看器(A) 从对照（黑色）和20 μM巴氯芬预应用（红色）切片中，在颞叶刺激后str. L-M记录的场兴奋性突触后电位（fEPSP）响应示例。轨迹显示为初始基线（实线）、alveus LTP诱导后（虚线）和str. L-M 1×100 Hz HFS后（灰色/粉色线）。右侧，所有fEPSP记录的汇总时间过程，标准化为初始基线，指示LTP诱导点（闪电符号）。(B) 在alveus刺激后，所有记录中str. L-M（SLM，闪电符号）诱导的LTP时间过程，标准化为20–30分钟基线。(C) 在str. L-M HFS后50–60分钟，所有记录中fEPSP易化的幅度。数据来自15个切片（对照）和19个切片（巴氯芬预应用）。(D) 在对照和巴氯芬预应用切片中，成功诱导LTP（HFS后50–60分钟易化>10%）的记录比例。(E) 在成功诱导LTP的记录中，str. L-M诱导的LTP时间过程，标准化为alveus刺激后的20–30分钟基线。(F) 在str. L-M HFS后0–1（左）、20–30（中）和50–60（右）分钟，对照和巴氯芬预应用切片中fEPSP易化的量化。数据来自12个切片（对照）和10个切片（巴氯芬预应用）。(G) 两组中所有记录的fEPSP斜率和刺激强度的比较。数据显示为均值±SEM（A、B、E）或箱线图，显示25%–75%箱体和中位数，最大范围（C和F）、比例（D）或单个数据（G）。单个细胞数据显示为叠加。统计显示为：ns，不显著；p > 0.05，?p < 0.05；来自Mann-Whitney非参数检验。这些数据证实，延长GABABR激活导致SST IN中GABAB1、mGluR1α和CaV1.2表面表达下调，对CA1微回路在str. L-M中编码输入的能力产生深远影响。讨论在本研究中，我们检验了持续GABABR激活导致海马SST IN受体丢失，释放突触可塑性抑制的假设。我们未能支持这一假设，并表明巴氯芬给药导致SST IN中GABABR、CaV1.2以及mGluR1α的表面表达降低，而抑制PP2A可阻止这一过程。大量表面受体和通道的丢失损害了SST IN长期发生突触可塑性的能力，进而改变了颞叶输入处的可塑性平衡。这些数据揭示了一种新的长期去抑制机制，有可能在行为相关时间尺度上塑造CA1区域的可塑性景观。PP2A依赖性膜定位GABABR的减少调节SST在活动SST IN是皮层回路的关键元件，门控来自内嗅皮层的输入强度及其可塑性，以及海马本身的联合输入。这些效应通过直接抑制突触后CA1 PC、突触前抑制谷氨酸能和GABA能输入以及调节星形胶质细胞功能的复杂相互作用介导。SST IN活性导致海马回路深刻去抑制，以加强CA3输入并限制CA1 PC树突功能。因此，SST IN本身的可塑性可能改变CA1功能的平衡，直接影响涉及情境信息的CA3依赖性行为。我们先前的工作表明，GABABR急性抑制SST IN上包含CaV1.2亚基的L型VGCC，以抑制LTP，这导致我们假设GABABR下调会促进LTP诱导，因为这一关键抑制机制丧失。我们未能证明这一假设，情况似乎相反，这是由于关键LTP机制（即mGluR1α和L型VGCC）的同步丢失；这依赖于PP2A的激活，并且已被认为与其他脑区的GABABR磷酸化有关。虽然我们没有明确提供GABABR内化的直接证据，但先前的研究已证实PP2A依赖性表面丢失由内化介导。然而，一个合理的替代可能性是受体表达被GABABR亚基寡聚化掩盖，这可能降低抗体结合。这不能解释CaV1.2和mGluR1α表面密度的同时降低。GABABR丢失的其他命运，如蛋白质降解或再循环，都需要通过网格蛋白介导的内吞作用进行初始内化。PP2A如何调节GABABR、CaV1.2和mGluR1α表面表达仍未确定。GABABR激活后，腺苷酸环化酶活性被抑制，导致cAMP水平降低和蛋白激酶A（PKA）激活减少，进而限制GABAB2亚基上丝氨酸892的磷酸化，使表面受体不稳定。此外，PP2A使GABAB1亚基上的丝氨酸783去磷酸化，也导致内化。由于mGluR1α是密切相关的C型G蛋白偶联受体（GPCR），这些受体可能通过重叠的细胞内级联靶向，特别是已知PP2A调节mGluR1的再循环。对于CaV1.2，情况更为复杂，因为抑制PP2A阻止了GABABR激活时其从SST IN膜上移除，但尼非地平敏感电流未恢复。鉴于SST IN树突中GABAB1与CaV1.2的紧密邻近，它可能与SST IN中的GABABR结合并共内化，如其他脑区Kir3通道所发生的情况。然而，CaV1.2活性受PKA磷酸化和PP2A上调，因此抑制后者可能进一步失调这些通道。然而，这些机制仍不清楚，应作为未来详细研究的基础。除了mGluR1α和VGCC外，天然GABABR与各种跨膜和胞质蛋白相互作用，在组织裂解物中测量时。如果在SST IN中存在相同的相互作用组，以及是否其他相关蛋白同样从这些细胞中丢失，仍未被探索。事实上，GABABR与其他突触后效应器（如Kir3通道）的功能关联在不同IN类型中有所不同。由于IN仅占海马神经元约10%，使用大量蛋白质样本识别GABABR相互作用组的努力可能低估了细胞类型特异性效应。未来单细胞蛋白质组学分析的进展可能允许检测细胞类型特异性的GABABR结合伙伴，对确定这种详细功能至关重要。GABABR从SST IN树突下调损害海马回路功能长期以来人们认识到，急性GABABR激活在回路水平导致矛盾功能，特别是增强LTP和增加癫痫活动，尽管直接超极化膜，并抑制PC上的突触前和突触后Ca2?通道。这些效应指向超出直接抑制的功能（支持去抑制模型），例如GABABR对海马多种IN类型的抑制。我们的数据进一步表明，长期激活GABAB受体能够从根本上改变生长抑素中间神经元（SST INs）在行为相关时间尺度上发生长时程增强（LTP）的能力。鉴于SST IN的LTP已被充分证实与多种行为功能相关，包括空间记忆和情境记忆等，这表明GABAB受体在调节该活动中可能发挥作用。我们证实，如先前报道所述，SST IN中的LTP对于通过TA通路维持向CA1区的信息传递至关重要，而预先应用巴氯芬会损害其调控作用。行为学实验部分支持了这一结论，表明在情境恐惧条件反射前给予巴氯芬会损害这些依赖于SST IN的记忆的获取和回忆（图S5）。然而，由于系统性给予巴氯芬对参与恐惧记忆的多个脑结构具有非特异性作用，因此对这些发现的解释并非直接明了。未来使用CA1区SST IN特异性敲除GABAB异构体的研究将有助于阐明这些效应。

此外，我们发现，在情境恐惧条件反射前激活GABAB受体足以阻止记忆编码。虽然先前已有研究表明巴氯芬会损害恐惧条件反射，但这些研究依赖于在恐惧获取前立即（<15分钟）给药，提示其具有直接的抑制作用。巴氯芬的药代动力学表明，腹腔注射30分钟后脑内浓度达到峰值，并在数小时内保持高水平。因此，几乎不可能估计SST IN中LTP的丧失何时（以及是否）超过了GABAB受体抑制所驱动的抑制作用。未来研究巴氯芬注射后数小时至数天内SST IN上GABAB受体的表面定位可能揭示这种关系的时间分辨率，但这超出了本项目的范围。

**转化意义**

巴氯芬是一种常见且重要的药物，主要用于治疗肌肉痉挛，但也用于测试酒精依赖、神经发育障碍等疾病（Romito等人），剂量可达100 mg/天；但该药与许多常见的神经系统副作用相关。因此，了解巴氯芬如何影响皮层回路可能有助于指导其最佳使用，特别是在GABA能抑制也涉及的情况下。

与巴氯芬给药相关的最常见临床特征之一是惊厥活动的矛盾性诱导，这在患者和啮齿类动物模型中均有观察到。巴氯芬最初被提出作为潜在的抗惊厥药物，但其对海马回路的影响此前已有描述，可导致惊厥样活动。我们观察到的巴氯芬依赖性SST IN兴奋性信号传导的丧失可能有利于局部SST IN抑制的长期减少，这将可预测导致惊厥。有趣的是，我们最近在经历过惊厥的患者中显示锥体细胞（PCs）中GABAB受体信号传导增强。推测这种增强可能是由于抑制性张力降低导致的代偿性受体表达上调，但需要进一步研究来确定是否如此。

高剂量巴氯芬的近期超适应症用途之一是治疗成瘾，特别是酒精使用障碍。在啮齿类动物中，已显示GABAB受体在慢性酒精给药后于皮层中丧失，在给予苯丙胺或可卡因后于腹侧被盖区（VTA）中丧失，尽管未在SST IN中进行测试。然而，已表明急性酒精给药双向影响SST INs，低剂量增加其活性而高剂量减弱其活性。SST INs存在于皮层和VTA回路中，在慢性饮酒小鼠中其活性被强烈下调，这可以通过直接抑制它们来纠正。我们的数据表明，长期巴氯芬给药可能会阻止SST IN活性，类似于先前使用的化学遗传学方法，因此可能反映了巴氯芬产生治疗益处的机制。

**总结与展望**

在此，我们展示了在海马SST INs中，GABAB受体的长期激活足以通过PP2A依赖性过程引起受体在质膜上的下调，这也导致mGluR1α和CaV1.2的表面密度降低，从而阻止CA1 PC输入处的突触可塑性。这些数据提供了令人信服的证据，表明抑制性分子巴氯芬通过降低SST IN功能而产生矛盾的去抑制效应，这与海马功能和疾病相关。

**研究局限性**

虽然我们显示在巴氯芬应用20分钟后，SST IN树突膜上表面定位的GABAB受体减少，但使用我们的方法无法确定这种丧失的特定时间动态。这些效应是迅速发生（数秒内）还是需要更长时间（数分钟至数小时）仍不清楚。然而，巴氯芬作为治疗药物通常以中高剂量给药（最高100 mg/天），其脑脊液半衰期为数小时，因此这种时间动态——虽然具有机制上的意义——在一定程度上被这些药代动力学所抵消。进一步研究确定SST IN树突上GABAB受体的减少是否表现出剂量和时间依赖性，将为巴氯芬的治疗使用提供重要见解。此外，我们尚未确定巴氯芬给药后SST INs恢复完全可塑性潜力所需的时间，这可能为回路功能提供信息。

我们数据中一个不寻常的观察是，在SDS-FRL实验中，OA似乎阻断了SST INs和CA1 PCs上GABAB1的标记（图S3）。我们对这一效应没有很好的解释。一种可能性是SDS-FRL依赖于膜结合蛋白的免疫标记，而OA作为一种大型多肽，与PP2A上靠近其与GABAB1相互作用位点的表位相互作用。这种相互作用可能掩盖或阻断抗体的结合，而使用小分子药理学（如fostriecin）则不会观察到这种现象。类似的现像已被提出用于淀粉样前体蛋白（APP）与GABAB1的结合，在SDS-FRL中显示APP过表达小鼠中该结合减少，但这些小鼠的GABAB受体功能并未改变。这些数据表明，提供多重证据以支持基于生理学或解剖学单独得出的结论的重要性，我们通过比较使用OA和fostriecin（两者均选择性抑制PP2A）提供了这一点。

最后，我们的数据表明，在SST INs中，GABAB受体可能与其自身相互作用，并影响mGluR1α、Cav1.2和PP2A的功能。这些蛋白并未出现在先前发表的海马GABAB1或GABAB2相互作用组中。我们的数据表明存在细胞类型特异性的相互作用组，这些可能无法在全脑甚至区域特异性水平上检测到。这样的努力几乎肯定会鉴定出神经化学定义的类别内部的细胞类型特异性差异，正如先前研究所强调的那样。然而，这类分析超出了当前研究的范围。未来的工作应寻求以细胞类型特异性方式鉴定GABAB受体与哪些蛋白相互作用，并可能确定这些相互作用是否随年龄或神经病理学改变。

**资源可用性**

**主要联系人**

有关资源和试剂的其他信息和请求应直接联系并将由主要联系人Sam A. Booker（[e-mail]）处理。

**材料可用性**

本研究未生成新的独特试剂。

**数据与代码可用性**

• 本文未报告原始代码
• 所有对本手稿有贡献的原始数据均在补充表“Sethumadhavan et al._raw data and statistics”中提供。
• 重新分析本文所报告数据所需的任何额外信息均可应要求从主要联系人处获取。

**致谢**

我们要感谢Natalie Wernet和Julia Bank的技术支持，Britt Van De Gevel的额外统计分析，BVS技术人员对动物饲养的支持，以及Booker、Vida和Kulik实验室成员对数据的讨论。资助来源：英国研究与创新署（UKRI）- 医学研究理事会（MR/Y014529/1，授予S.A.B.）；德国研究基金会（DFG）（FOR 2134，授予I.V.和A.K.），BIOSS-2（授予A.K.），CRC-TRR 384/1（授予I.V.和A.K.），Patrick Wild中心（授予S.A.B.），以及西蒙斯大脑发育倡议（SFARI：529085）。

**作者贡献**

概念化，S.A.B.和A.K.；方法学，N.S.、S.A.B.、M.A.W.、A.S.、D.L.和A.K.；验证，S.A.B.和A.K.；正式分析，S.A.B.、A.K.、N.S.、M.A.W.和A.S.；调查，S.A.B.、N.S.、M.A.W.、D.L.、A.S.和R.M.L.；写作-初稿，S.A.B.；写作-审阅与编辑，S.A.B.、N.S.、I.V.和A.K.；监督，S.A.B.、I.V.和A.K.；资金获取，S.A.B.、I.V.和A.K.

**利益声明**

作者声明无竞争利益。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 抗GABAB1 | Kulik等人 | B17 |
| 抗mGluR1α | Frontier Institute | Af660；RRID：AB_2571801 |
| 抗CaV1.2 | NeuroMab | N263/31；RRID：AB_2877476 |
| 抗GFP | Aves Labs | GFP-1010；RRID：AB_2307313 |
| 抗生长抑素 | BMA Biomedicals | T-4103；RRID：AB_518614 |
| 链霉亲和素Alexa Fluor 633 | Invitrogen | S21374；RRID：AB_2336066 |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| R-巴氯芬 | Abcam Biochemicals | ab120325 |
| CGP-55,845 | Abcam Biochemicals | ab120337 |
| 印防己毒素 | Abcam Biochemicals | ab120315 |
| CNQX | Abcam Biochemicals | ab120044 |
| DL-AP-5 | Abcam Biochemicals | ab120271 |
| QX-314 | Abcam Biochemicals | ab120118 |
| S-DPHG | Abcam Biochemicals | ab120007 |
| 硝苯地平 | Abcam Biochemicals | ab120135 |
| LY-367,385 | HelloBio | HB0398 |
| 冈田酸 | HelloBio | HB0468 |
| Fostriecin | HelloBio | HB0293 |
| **沉积数据** | | |
| 原始数据 | 本研究 | 补充材料 |
| **实验模型：生物体/品系** | | |
| 小鼠：vGAT-venus | Wang等人 | N/A |
| 小鼠：生长抑素-cre（Ssttm2.1(cre)Zjh/J） | Jackson Laboratory | 013044 |
| 小鼠：Ai32RCL?ChR2(H134R)/EYFP | Jackson Laboratory | 024109 |
| 小鼠：C57/Bl6J（CRL亚品系） | Charles River | 027 |
| **软件和算法** | | |
| pClamp | Molecular Devices | |
| Stimfit | Guzman等人 | |
| FIJI/ImageJ | Schindelin等人 | |
| WinLTP 3.01 | WinLTP Ltd. | |
| RStudio | Posit Software, PBC | |
| Graphpad Prism 11 | Dotmatics | |

**实验模型和研究参与者详情**

所有离体电生理学实验均在来自雄性和雌性小鼠（2-4个月龄）的脑切片中进行，所有程序均按照内政部（ASPA，2013）和爱丁堡大学伦理委员会（AWERB）的规定执行，项目许可证号PP2262369。小鼠维持在C57/Bl6JCRL背景下，并在囊泡GABA转运体（vGAT）启动子下表达黄色荧光蛋白（YFP）。小鼠饲养在12小时光照/黑暗循环下，可自由获取食物和水。

对于SDS-FRL实验，雄性小鼠（8周龄，n = 12），无论是野生型还是SST-INs选择性表达Channelrhodopsin2（ChR2）-YFP融合蛋白的小鼠，均来自SST-Cre和Ai32RCL-ChR2（H134R）/EYFP转基因小鼠的杂交。对于行为分析，使用雄性C57/Bl6J小鼠（8-12周龄，每组n = 6）。实验程序前后动物的护理和处理遵循欧盟和国家法规（德国动物福利法），所有实验均按照机构指南（德国弗莱堡大学）执行，并获得当地主管部门许可（Freiburg，X21/04B）。

**方法详情**

**急性脑切片制备**

脑切片按先前描述的方法制备。小鼠用异氟烷深度麻醉，断头，然后快速解剖大脑置于冰浴的蔗糖改良人工脑脊液（sucrose-ACSF；ACSF；mM：87 NaCl，2.5 KCl，25 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，25葡萄糖，75蔗糖，7 MgCl2，0.5 CaCl2）中，并用碳合气（95% O2/5% CO2）饱和。大脑粘附于振动切片机载物台（Leica VT1200S，Leica，德国），然后制备含有海马的300 μm（用于全细胞记录）或500 μm（用于细胞外记录）水平切片。切片后，脑切片置于以下两种环境中之一：含有加热至35 °C 30分钟然后在室温下放置的蔗糖-ACSF的浸没式保持腔；或置于放置在液/气界面腔中的小滤纸片上，含有记录用ACSF（mM：125 NaCl，2.5 KCl，25 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，25葡萄糖，1 MgCl2，2 CaCl2），并用碳合气鼓泡。

**全细胞膜片钳记录**

简言之，如先前所述，从60-90日龄C57/Bl6J小鼠制备400 μm水平海马切片。记录时，将切片转移至维持在31 ± 1°C的浸没式腔中。使用填充有K-葡萄糖酸盐或Cs-葡萄糖酸盐基溶液的电极为全细胞记录。电压钳记录在-65 mV或-60 mV电位下进行，而电流钳记录在静息膜电位下进行。记录神经元的固有特性通过在电流钳下对超极化至去极化电流阶跃的电压响应来表征。在存在10 μM CNQX、50 μM DL-AP-5和50 μM印防己毒素的情况下测量高电压激活钙瞬变、mGluR EPSCs和GABAB受体介导的电流。GABAAR IPSCs通过在str. lacunosum-moleculare中放置双极刺激电极，距离记录神经元约200-300 μm吻侧，在存在10 μM CNQX、50 μM DL-AP-5的情况下诱发。在存在50 μM印防己毒素的情况下，通过放置在海马槽（alveus）中的双极刺激电极诱发的EPSCs，在SST INs的alveus输入处诱导LTP。基线记录后，通过theta-爆发刺激范式诱导联合LTP——由5串5个电刺激（100 Hz）组成，与去极化至-20 mV配对，以30秒间隔重复3次。诱导后测量EPSCs持续25分钟。对于所有刺激，脉冲持续时间为200 μs，通过恒压发生器传送。对于HVA VGCC激活，一旦使用Cs-葡萄糖酸盐内液（含QX-314）获得全细胞膜片钳记录，让细胞透析5分钟。然后在-60 mV电压钳下，施加3组去极化阶跃（-60至20 mV，5 mV步进，500 ms持续时间）。然后将L型VGCC阻滞剂硝苯地平（20 μM）浴施3分钟，并获取另外3组去极化阶跃。所有轨迹随后基于5 mV阶跃进行P/N扣除，并测量峰值电流。硝苯地平下的峰值电流随后从对照中减去。对于mGluR EPSC实验，通过置于胞体约50 μm处的膜片电极局部喷射I组mGluR激动剂DPHG（100 μM，500 ms，20 psi，从150 mM NaCl储备液中稀释）诱发慢EPSC。mGluR电流的特异性通过随后浴加mGluR1α特异性拮抗剂LY-367,385（100 μM）进行评估。对于预给药实验，脑片转移到含有记录用ACSF和20 μM R-巴氯芬的孵育小室中20分钟，然后将脑片置于记录小室中，用不含R-巴氯芬的ACSF冲洗4-6分钟后进行记录。为了阻断PP2A活性，脑片在记录或巴氯芬预给药前至少1小时转移到含有ACSF和1 μM冈田酸或50 nM Fostriecin的小室中。所有其他药物直接加入灌注的ACSF中。

场电位记录

对于场兴奋性突触后电位（fEPSP）记录，海马脑片转移到界面记录小室中，以2-3 mL/min的速率灌注经碳氧合的人工脑脊液（ACSF），并维持在30 ± 1 °C。记录电极（1-3 MΩ）用水平拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm/内径0.86 mm；Harvard Apparatus，英国）拉制，并填充记录用ACSF。脑片用宽视野显微镜（Leica，德国）可视化，电极置于CA1的str. L-M中。

使用双极刺激电极通过双脉冲方案诱发电场fEPSP，刺激电极置于str. L-M中，距记录电极约500 μm至1 mm，以激活temporoammonic通路。第二个刺激电极平行放置在CA1的alveus中。为了激活GABABR，脑片用20 μM巴氯芬灌注20分钟，随后进行20分钟的洗脱期。

在对照条件下或巴氯芬洗脱后记录10分钟基线。首先通过alveus刺激使用高频刺激（HFS）方案诱导LTP，该方案由三次100 Hz、20脉冲的串组成，间隔30秒，或由五次100 Hz、5脉冲的串组成，间隔30秒。随后在str. L-M中使用1次100 Hz、100脉冲的HFS方案（间隔30秒）诱导LTP。

诱导后监测强直增强60分钟。LTP幅度量化为诱导后50-60分钟测量的平均fEPSP斜率，归一化至10分钟基线。如果50-60分钟斜率超过基线>10%，则认为LTP成功。如果基线稳定性（通过比较1-2分钟和9-10分钟的平均斜率评估）变化±10%，则排除记录。信号在线滤波（1 Hz高通，500 Hz低通）并以10 kHz数字化。使用WinLTP（v3.01，布里斯托尔大学，英国）离线采集和分析数据。

神经元可视化和免疫组织化学

所有神经元在记录期间用生物胞素填充，在4% PFA中固定过夜，并根据先前方法用链霉亲和素和SST抗体标记。脑片在PBS中洗涤，然后在室温下封闭1小时（10% NGS，0.3% Triton X-100和0.05% NaN3溶于PBS）。封闭后，脑片在4°C下与一抗孵育48小时（1:1000兔抗SST-14，T-4103，BMA Biomedicals，瑞士；5% NGS，0.3% Triton X-100和0.05% NaN3溶于PBS），在PBS中洗涤，然后转移到含有荧光偶联链霉亲和素的二抗溶液中（1:500山羊抗兔AlexaFluor 488，1:500链霉亲和素AlexaFluor 633，3% NGS，0.1% Triton X-100，0.05% NaN3）。标记后，脑片在0.1M PB中洗涤，并用Vectashield HardSet封片剂（Vector Labs，英国）封片于载玻片上。为了鉴定SST Ins，在Leica SP8共聚焦显微镜上用63x（1.4 NA）物镜以1024 × 1024分辨率（Z步长1 μm）对记录的神经元拍摄共聚焦图像堆栈。

电子显微镜

SDS-FRLA的急性脑片制备和药理学处理

急性海马脑片按先前描述制备。动物用异氟烷镇静，然后断头，快速解剖大脑，并在半冷冻的碳氧合（95% O2/5% CO2）蔗糖替代人工脑脊液（蔗糖-ACSF，mM：87 NaCl，2.5 KCl，25 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，25葡萄糖，75蔗糖，7 MgCl2，0.5 CaCl2，1 Na-丙酮酸，1 Na-抗坏血酸）中冷却。在振动切片机（VT1200s，Leica，德国）上切取横向海马脑片（200 μm厚），储存在35°C温热的蔗糖-ACSF中至少30分钟，随后在室温（RT）下保存。整个实验过程中，两种溶液均用95% O2和5% CO2混合气体平衡。急性脑片分为四组进行药理学处理：1，在ACSF中孵育（对照，30分钟），2，ACSF + GABABR激动剂巴氯芬（Bac，20 μM，20分钟），3，ACSF + 蛋白磷酸酶2A抑制剂fostriecin（FS，50 nM，90分钟），4，ACSF + fostriecin + 巴氯芬（FS/Bac，FS 50 nM 90分钟 + Bac 20 μM，20分钟）。药理学处理后，脑片转移到含有1%多聚甲醛和15%饱和苦味酸（溶于0.1 M磷酸缓冲液PB）的固定液中，在4°C下过夜（O/N）固定。

SDS-FRL免疫电子显微镜

固定后，脑片在含30%甘油的0.1M PB中于4°C过夜冷冻保护。从脑片上修剪含有str. O/A的块，并在高压下冷冻（HPM 100，Leica）。冷冻样品在-140°C下断裂，断裂面在冷冻断裂复型机（ACE 900，Leica）上依次涂覆碳（5 nm）、铂-碳（2 nm）和碳（18 nm）。复型在80°C下用含2.5% SDS和20%蔗糖（溶于15 mM Tris缓冲液TB，pH 8.3）的溶液消化20小时。随后，复型在含0.05%牛血清白蛋白（BSA，Roth，德国）和0.1% Tween 20的洗涤缓冲液（溶于50 mM Tris缓冲盐水TBS）中洗涤，然后在含5% BSA和0.1% Tween 20的TBS溶液中于室温封闭1小时。之后，来自SST-cre小鼠的复型在含1% BSA和0.1% Tween 20的TBS溶液中与以下一抗混合物在15°C下孵育3天：(i) GABAB1（B17，兔，10 μg/ml）和绿色荧光蛋白（GFP-1010，鸡，0.4 μg/ml，Aves Labs，俄勒冈；Booker等，2020）或(ii) Cav1.2（小鼠，50 μg/ml，NeuroMab Facility，加利福尼亚；Booker等，2018）和GFP。复型洗涤后，与6 nm（GABAB1和Cav1.2）和18 nm（GFP）金颗粒偶联的二抗（1:30，Jackson ImmunoResearch Europe，剑桥郡）在15°C下反应过夜。来自WT小鼠的复型在含1% BSA和0.1% Tween 20的TBS溶液中与Cav1.2（小鼠，50 μg/ml，NeuroMab Facility，加利福尼亚）、GABAB1（B17，兔，10 μg/ml）和代谢型谷氨酸受体1α亚基（mGluR1α，豚鼠，0.4 μg/ml，Frontier Institute，北海道；Booker等，2018）在15°C下孵育3天。复型洗涤后，与5 nm（GABAB1）、10 nm（Cav1.2）和18 nm（mGluR1α）金颗粒偶联的二抗（1:30，Jackson ImmunoResearch Europe，剑桥郡）在15°C下反应过夜。最后，复型在TBS和蒸馏水中洗涤，并装载在100目铜网上。

电子显微镜和蛋白密度定量分析

标记的复型在电子显微镜（JEM 2100 Plus）下分析。由于所有抗体靶向细胞内蛋白表位，免疫反应性可在质膜的原生质面（P-face）上检测到，但不能在外质面（E-face）上检测到。受体和离子通道的表面密度通过将标记目标分子的颗粒绝对数除以复型上GFP阳性SST-IN树突干相应节段的表面积来确定。

行为学分析

为了研究GABABR激活在恐惧学习中的作用，我们进行了恐惧条件化实验。雄性C57/Bl6J小鼠（8-12周龄，每组n=6）被处理和适应。在测试当天，小鼠接受两分钟的基线期，然后接受三次足部电击（0.06 mA），间隔一分钟。在最后一次电击后，小鼠在恐惧条件化场地中停留额外一分钟，然后转移到 home cage。整个训练过程持续约五分钟。小鼠分为测试组和对照组。测试组注射巴氯芬（i.p.，2 mg/kg），而对照组接受溶剂（0.9% NaCl）。在巴氯芬或溶剂注射一小时后，在相同情境中测量僵直时间以评估恐惧记忆。

定量和统计分析

对于离体电生理，每只动物和每种处理记录一或两个细胞或脑片，限制了评估动物内变异性的能力。因此，细胞和脑片被视为独立重复，并对这些数据进行统计分析。适当时应用参数和非参数检验，包括双因素ANOVA、Student's t检验、Mann-Whitney U检验和Wilcoxon符号秩检验。对于SDS-FRL，由于每只动物重复中采样了许多树突轮廓，我们使用“lmer”函数进行线性混合效应建模（LMM），以限制潜在伪重复的纳入。动物被分配为随机效应，然后对模型进行III型ANOVA（Satterthwaite方法）以评估主效应（例如药物处理）。如果观察到主效应之间的统计交互作用，则进行事后分析（Tukey事后检验）。关键统计检验结果在图表和正文中显示。所有数据以箱线图显示，箱内显示中位数和25-75百分位数；最小值和最大值范围以须显示，个别数据点来自细胞或动物平均值。对于时间过程和电流-电压图，数据以平均值±SEM显示。没有数据被排除在分析之外。统计显著性定义为p < 0.05。统计检验和绘图使用GraphPad Prism（GraphPad Software v10.4.1，San Diego，CA，美国）或R-Studio进行。

补充信息（2）
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