《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Diagnostic Timelines in Acute Leptospirosis: A Four-Patient Case Series
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急性钩端螺旋体病（acute leptospirosis）因临床表现非特异且早期血清学检测可能呈阴性而难以诊断。研究人员回顾性分析了通过两家医院电子病历检索确定的四例符合条件的钩端螺旋体病确诊患者，并重建了其诊断时间线。配对显微镜凝集试验（microscopi
急性钩端螺旋体病（acute leptospirosis）因临床表现非特异且早期血清学检测可能呈阴性而难以诊断。研究人员回顾性分析了通过两家医院电子病历检索确定的四例符合条件的钩端螺旋体病确诊患者，并重建了其诊断时间线。配对显微镜凝集试验（microscopic agglutination test, MAT）独立确认了全部四例患者的钩端螺旋体病。研究人员分析了急性期血浆宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）、对保存的急性期血清进行的后续逆转录定量聚合酶链反应（reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）以及配对酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和MAT结果。所有患者均出现发热和全身炎症，其中三例发展为感染性休克。原始mNGS报告中包含4–42,125条归属于所报告钩端螺旋体（Leptospira）物种的读长（reads），并在临床诊疗过程中提供了钩端螺旋体病的首要病因学线索。所有急性期血清RT-qPCR均呈阳性，循环阈值（cycle threshold, Ct）分别为30.80、33.52、26.92和34.70。所有患者急性期MAT均为阴性。三例患者ELISA IgM和IgG均为阴性，而病例4在第8天IgM阳性但IgG阴性。恢复期时，所有患者ELISA IgM和IgG均转为阳性，MAT滴度升至1:3200、1:1600、1:400和1:800。这些发现强调，分子和血清学结果应根据采样时间进行解读。
钩端螺旋体病（leptospirosis）是一种由致病性钩端螺旋体（Leptospira）引起的人畜共患疾病，其临床表现高度异质，从自限性发热性疾病到黄疸、急性肾损伤、肺出血和多器官功能障碍不等，重症病例死亡风险显著。由于早期症状缺乏特异性，易与流感、登革热、脓毒症及其他急性发热性疾病混淆，及时临床识别仍具挑战。浙江省舟山市曾有钩端螺旋体病流行史，但据当地流行病学调查，在2022年发现一例患者前约40年无本地报告病例，后续调查在患者住所附近的居民和动物宿主中检测到钩端螺旋体感染证据，提示长期无报告病例并不等于无本地感染风险。传统血清学检测如酶联免疫吸附试验（ELISA）和显微镜凝集试验（MAT）是重要诊断方法，但因抗体反应具有时间依赖性，病程早期结果可能为阴性；而PCR可在感染早期检测钩端螺旋体核酸，宏基因组二代测序（mNGS）也已被用于重症或非典型钩端螺旋体病的病因学鉴定。然而，既往基于mNGS的病例报告主要强调早期病原体检测，对同一患者中mNGS结果与分子检测及急性和恢复期血清学结果之间关系的纵向详细描述仍有限。为此，研究人员利用四例患者的急性期标本分子检测结果及配对急性和恢复期血清学结果，重建了从症状发作到血清学确认的个体化诊断时间线，并描述了不同病程阶段各项检测所提供的证据。
研究人员开展了一项回顾性、两中心病例系列研究，时间跨度为2022年4月至2024年7月，在舟山医院和浙江普陀医院通过电子病历系统检索诊断字段含“钩端螺旋体”的患者，共识别出四例符合标准的患者。纳入标准包括：符合急性发热性疾病表现、配对MAT确认、临床诊疗中完成急性期血浆mNGS检测、以及有保存的急性期血清样本可供回顾性RT-qPCR检测和配对急、恢复期血清用于ELISA和MAT。配对MAT作为独立于被评估分子检测的确认标准，依据WS 290-2008标准，单次MAT滴度≥1:400或配对血清间滴度四倍及以上升高视为确认。研究人员从电子病历中提取人口学特征、流行病学暴露史、主要临床表现、实验室发现、治疗经过和结局，以症状发作日为第0天，将病程第3–8天采集的血清归为急性期，第29–64天采集的血清归为恢复期，并重建了住院、mNGS采样及报告、急性期血清采集、青霉素治疗启动和恢复期血清采集等时间点。
主要关键技术方法包括：急性期血浆mNGS检测，由杭州杰毅医学检验实验室完成，采用基于可逆终止子测序化学的宏基因组DNA文库制备试剂盒，在Illumina NextSeq 550Dx平台以单端50 bp策略测序，去除低质量和人源读长后与NCBI GenBank及实验室自建微生物基因组数据库比对，报告流程应用了试剂或环境污染、索引跳跃、交叉污染及近缘物种分类错误等过滤条件；回顾性RT-qPCR检测，在舟山市疾病预防控制中心对保存的急性期血清进行，采用一步法逆转录定量PCR，靶向钩端螺旋体rrs（16S rRNA）序列，阳性对照为致病性问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）国家参考株56601（血清群Icterohaemorrhagiae，血清型Lai），以Ct<35为阳性报告标准；血清学检测包括ELISA IgM和IgG定量检测及MAT，MAT按WS 290-2008标准采用15株中国参考菌株面板，急性期和恢复期血清从1:50开始倍比稀释，以单次滴度≥1:400或配对血清四倍及以上升高为阳性。
研究结果部分如下。个体病例呈现：病例1为79岁男性，发病第2天因头晕入院，初始疑诊眩晕，随后出现发热、肌痛、低血压和血小板减少，第5天采集血浆行mNGS，第6天报告提示波哥达钩端螺旋体（Leptospira borgpetersenii），第6天改用青霉素治疗。病例2为65岁女性，发病第4天因发热和呼吸困难入院，双侧肺部浸润、血小板减少及肝肾功能障碍导致初始诊断为重症肺炎伴多器官功能障碍，第5天转入ICU并机械通气，第7天采集血浆行mNGS，第8天报告提供钩端螺旋体感染病因学线索并启动青霉素治疗。病例3为77岁男性，发病第3天因发热、咳嗽和咳痰入院，低血压、血小板减少、显著全身炎症及轻中度肝肾功能障碍导致初始诊断为脓毒症、感染性休克和肺部感染，第6天采集血浆行mNGS，第7天报告提供病因学线索并启动青霉素治疗。病例4为45岁男性，发病当天因急性头晕和构音障碍入院，疑诊脑梗死行静脉溶栓，因显著血小板减少和CRP升高而停用，第2天出现发热、肌痛和结膜充血，第7天采集血浆行mNGS，第8天报告提供病因学线索并启动青霉素治疗。总体临床特征：四例患者均出现发热、血小板减少和显著全身炎症，血小板最低值15–45×109/L，三例发生感染性休克，两例有呼吸系统受累，其中一例需机械通气，住院时间12–19天，均临床改善后出院。急性期分子发现和诊断时间线：病例1 mNGS报告42,125条归属于波哥达钩端螺旋体的读长，病例2–4分别报告44、12和4条归属于钩端螺旋体物种的读长，后三例被解读为属水平病因学线索而非确认证据；回顾性RT-qPCR在全部四例急性期血清中均阳性，Ct值26.92–34.70。急性和恢复期血清学变化：病例1–3急性期血清（分别采集于病程第3、5、4天）ELISA IgM和IgG均阴性，病例4第8天血清IgM阳性但IgG阴性；恢复期血清（分别采集于第64、40、29、31天）全部患者ELISA IgM和IgG均阳性，MAT滴度从急性期全部<1:50升至恢复期1:3200、1:1600、1:400和1:800，四例均满足WS 290-2008血清学确认标准。
讨论部分指出，该病例系列整合了四例患者的临床病程、急性期mNGS发现、保存急性期血清的回顾性RT-qPCR结果和恢复期血清学发现，描述了其诊断时间线，说明当急性期血清学结果不足以确认诊断时，分子检测提供的病因学线索如何被恢复期血清学所佐证。与既往mNGS病例报告相比，临床报告的钩端螺旋体mNGS信号强度差异可很大，低读长数并非本系列独有。病例1和病例4具有非典型初始表现，分别以头晕和头晕、构音障碍及步态不稳起病，后者在发热出现前两日进入急性卒中诊疗路径，提示非典型初始表现可能将诊疗导向非感染性诊断，而随后的发热、血小板减少和全身炎症可能促使重新考虑感染性病因。研究局限性包括样本量小、回顾性两中心设计、无对照组、纳入需配对MAT和相关分子检测可能引入选择偏倚、RT-qPCR在mNGS提示临床怀疑后回顾性进行、物种分配和污染过滤未独立重新评估、病例2–4的物种分配仍为临时性、RT-qPCR方法学验证数据不完整、标本储存和核酸降解对Ct值的影响未量化、病例4的Ct值34.70接近阳性阈值35、替代感染诊断的排查因患者而异。研究结论为：在本四例病例系列中，血浆mNGS在临床诊疗中提供了钩端螺旋体感染的首要病因学线索，保存急性期血清的回顾性RT-qPCR提供了补充分子证据，配对MAT确认了全部四例患者的钩端螺旋体病，但这些观察并不能确立mNGS的诊断性能或临床获益。
