烟曲霉（Aspergillus fumigatus）隔膜形成关键组分Bud4与Rho4决定毒力及棘白菌素杀菌活性

《Infection and Immunity》：The Aspergillus fumigatus septation components Bud4 and Rho4 are essential for virulence

　　

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是肺部霉菌感染的主要病原体，其中最严重的是侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis, IPA）。当前获批的抗真菌药物受到耐药率上升和宿主毒性的威胁，迫切需要新的治疗选择。研究人员近期的工作提示，抑制隔膜形成（septation inhibition）可能是其中一种策略，因为烟曲霉无隔膜菌株对棘白菌素类抗真菌药物（echinocandin antifungal drugs）高度敏感，并在IPA动物模型中显示毒力显著降低。在本研究中，研究人员扩展了对锚蛋白样蛋白（anillin-like protein）Bud4和Rho GTP酶（Rho GTPase）Rho4的认识，二者分别调控构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和烟曲霉的隔膜形成。尽管AnBud4在构巢曲霉中对隔膜形成并非必需，但烟曲霉同源基因缺失（?bud4）导致隔膜形成完全丧失。在?rho4中也观察到类似表型，这与既往研究一致。支持菌丝隔膜形成在侵袭性曲霉病建立中的关键作用，研究人员发现?bud4和?rho4在IPA小鼠模型中表现为无毒性（avirulence），其特征是组织侵袭性生长丧失。此外，两种缺失突变均能够将抗烟曲霉棘白菌素活性从抑真菌（static）转化为杀真菌（cidal）。通过使用多西环素可抑制启动子系统（doxycycline-repressible promoter system）实现可滴定的bud4表达，研究人员还发现即使部分抑制隔膜形成也显著增加棘白菌素敏感性。综上所述，这些研究支持一种治疗策略，即可将隔膜形成抑制剂与棘白菌素联合使用，以减少组织侵袭性生长并改善抗真菌药物敏感性。

研究背景方面，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是环境中广泛存在的丝状真菌，可在土壤、腐败有机物、海洋生境甚至动物组织中生存；其分生孢子须萌发形成菌丝，而菌丝发育的关键环节是隔膜（septa）形成，隔膜作为横壁将菌丝分隔成区室并作为保护菌丝免受损伤的结构屏障。隔膜形成受隔膜起始网络（septation initiation network, SIN）调控，该通路在真核生物中具有保守的细胞分裂功能。既往研究显示，烟曲霉SIN上游单一组分丢失未与隔膜缺陷相关，但三个SIN激酶SepH、SepL和SidB突变会导致隔膜完全丧失并增加细胞壁应激下菌丝死亡；SepM或MobA丢失导致隔膜显著减少并增加细胞壁应激敏感性。无隔膜烟曲霉突变体对棘白菌素（echinocandins）高度敏感，并使棘白菌素由抑真菌转为杀真菌；相关突变体在小鼠侵袭性曲霉病模型中几乎无毒性，且组织侵袭能力丧失。既往工作主要集中于SIN信号组分，无法区分SIN信号中依赖隔膜与否的功能，因此需要研究核心SIN信号复合体之外的隔膜形成必需基因。文献提示，构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中Rho4、Bud3、Bud4等参与隔膜形成；烟曲霉Rho4已被部分表征，但其在毒力中的作用未知，烟曲霉Bud4同源蛋白则完全未表征。研究人员因此首次表征烟曲霉bud4同源基因在隔膜形成和细胞壁应激抗性中的作用，并检测?rho4和?bud4在小鼠侵袭性曲霉病模型中对毒力的影响。研究结论显示，Bud4与Rho4为SIN通路保守的下游效应因子；丢失bud4或rho4导致隔膜形成消除、细胞壁应激耐受性降低，并通过丧失组织侵袭性生长而使真菌无毒性。这些结果支持菌丝隔膜形成是烟曲霉毒力所需，并提示药理学抑制隔膜形成可能作为一种新型抗真菌策略，在降低毒力的同时增加对细胞壁靶向抗真菌药物的敏感性，具有重要意义。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑构建?bud4、?rho4及互补菌株；通过钙荧光白（calcofluor white, CFW）染色和荧光显微镜观察隔膜；开展径向生长、萌发率、产孢及斑点稀释和药物条扩散试验；用腺苷酸激酶（adenylate kinase, AK）释放 assay 评估菌丝损伤；用RT-qPCR验证基因表达；以A549肺泡上皮细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放评估细胞毒性；使用皮质类固醇免疫抑制的雌性远交CD-1小鼠（Charles River）IPA模型进行生存分析（n=10/组）和GMS组织学（n=3/组）；构建hspA启动子过表达株及多西环素可抑制的bud4^pTetOff株。

研究结果如下。1. 烟曲霉Bud4同源蛋白是菌丝隔膜形成和正常分生孢子发育所必需（The A. fumigatus Bud4 ortholog is required for hyphal septation and proper conidial development）。通过CRISPR/Cas9删除bud4和rho4并构建互补株，CFW染色显示?bud4菌丝无隔膜、?rho4罕见隔膜，互补后恢复；?bud4在72 h和96 h colony直径显著小于亲本和互补株，?rho4在72 h显示径向生长缺陷而96 h不显著；二者在最小培养基上形成白色菌落，提示分生孢子形成缺陷；两缺失株在4 h即出现芽管，而亲本和互补株6 h后才萌发，且8 h前萌发比例显著更高；丢失bud4和rho4导致单位面积分生孢子产量下降，且渗透压稳定未恢复。结论为二者对正常隔膜形成和分生孢子发育必需。2. 缺失Bud4产生对细胞壁应激的高度敏感并使棘白菌素具有杀菌活性（Loss of Bud4 generates hypersusceptibility to cell wall stress and imparts fungicidal activity of echinocandins）。斑点稀释试验显示?bud4和?rho4对刚果红（Congo red, CR）或CFW高度敏感，1.2 M山梨醇可恢复CFW下 phenotype 但不能恢复CR下 phenotype；药物条扩散中卡泊芬净（caspofungin, CFG）、阿尼芬净和米卡芬净虽最低有效浓度未变，但缺失株出现 clearance 区，琼脂块转接后无存活生长，证实杀真菌；CFG处理8 h germlings和16 h mycelia后，?bud4和?rho4的AK释放显著高于亲本和互补株，SIN激酶突变体也显示AK释放增加。结论为隔膜在棘白菌素抑制β-葡聚糖合成所致细胞壁损伤中具保护作用。3. Bud4或Rho4在SIN激酶缺陷突变体中过表达部分恢复菌丝隔膜形成和细胞壁应激下存活（Overexpression of Bud4 or Rho4 in a SIN kinase-deficient mutant partially recovers hyphal septation and survival under cell wall stress）。研究人员用强hspA启动子替换bud4或rho4原生启动子，RT-qPCR显示转录本较野生型高20倍以上；CFW染色显示在sidB-1背景中过表达bud4或rho4可部分恢复隔膜，出现稀疏隔膜，而在?sepH或sepL-1中未恢复；CFW斑点试验中，野生型背景下过表达不影响CFW敏感性，sidB-1背景中过表达提高CFW抗性，?sepH和sepL-1中虽未恢复隔膜但CFW抗性轻度改善；在?rho4中过表达bud4未恢复隔膜缺陷。结论支持Bud4/Rho4位于SIN下游并影响细胞壁应激存活。4. Bud4或Rho4对烟曲霉毒力必需（Bud4 or Rho4 are essential for A. fumigatus virulence）。在皮质类固醇小鼠IPA模型中，感染前1天皮下给予曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA），鼻内接种5 × 10⁶分生孢子，n=10/组，监测12天；野生型感染组70%死亡、互补株组60%死亡，?bud4和?rho4感染组完全无毒性且无症状；感染后4天肺组织GMS染色显示野生型菌丝侵袭分布于组织，而缺失株仅位于气道内、无组织侵袭；A549上皮细胞共培养24 h后，?rho4诱导的LDH释放与CEA10相似，?bud4显著低于CEA10，?sepH、sepL-1和sidB-1与CEA10无显著差异；其他无隔膜株未显示LDH释放下降，提示上皮损伤降低不能解释隔膜缺陷相关毒力丧失。结论为隔膜对烟曲霉正常毒力必需。5. 可诱导抑制隔膜形成改善棘白菌素活性（Inducible inhibition of septation improves echinocandin activity）。研究人员在bud4位点前引入四环素可抑制启动子构建bud4^pTetOff；无多西环素时隔膜正常，0.06 μg/mL时隔膜稀疏，1 μg/mL时隔膜完全阻断；去除多西环素后，bud4^pTetOff在正常位置同步恢复隔膜；随多西环素浓度升高，bud4^pTetOff菌落色素呈剂量依赖性丧失；药物条扩散中，多西环素不影响野生型对CFG的敏感性，而bud4^pTetOff在多西环素浓度升高时 clearance 区增大。结论为隔膜水平可滴定，即使部分抑制隔膜形成也显著增加棘白菌素敏感性。

讨论部分总结：研究确认锚蛋白样蛋白Bud4在烟曲霉隔膜形成中必需，支持其在丝状真菌中的功能保守；并确认Rho4对隔膜形成和细胞壁应激下存活必需。与SIN激酶突变体一致，?bud4和?rho4对细胞壁应激敏感且芽管出现更早；但二者在细胞壁应激高敏性不能被渗透压恢复方面与SIN激酶突变体不同，原文认为这可能提示Bud4或Rho4丢失产生比SIN激酶调控因子突变更严重缺陷。sidB-1中过表达bud4或rho4可恢复隔膜，支持二者位于SIN级联下游；野生型中过表达未引起明显隔膜增多，提示上游SIN组分可能存在化学计量限制；bud4过表达不能恢复?rho4、?sepH和sepL-1隔膜缺陷，原文讨论提出Rho4可能与上游SIN激酶并行激活收缩性肌动蛋白环机器等解释。bud4^pTetOff去除多西环素后隔膜在正常位置同步出现，提示隔膜位点在烟曲霉菌丝延伸中独立于Bud4选择，与构巢曲霉和粗糙脉孢菌中隔膜位点预定一致；烟曲霉是否存在类似粗糙脉孢菌隔膜肌动蛋白-肌球蛋白缠结的结构尚待研究。研究还显示随着bud4抑制增强，棘白菌素活性增加，提示隔膜丰度中度下降也可能提高棘白菌素疗效。?bud4和?rho4无毒性，类似SIN信号突变体，以组织侵袭性生长丧失为特征；其毒力降低机制仍未明确，体外细胞损伤试验不支持无隔膜株因不能损伤肺上皮而减毒的假说；原文讨论提出无隔膜菌丝可能因尖端区室膨压丧失而无法产生侵入宿主肺组织所需穿透力，并提及YakA相关研究。对于已建立感染的IPA患者，阻断隔膜形成的后果尚待确定；bud4^pTetOff株将有助于未来回答该问题。研究结论翻译：综上所述，这些研究支持一种治疗策略，即可将隔膜形成抑制剂与棘白菌素联合使用，以减少组织侵袭性生长并改善抗真菌药物敏感性。