达玛烷型三萜类化合物在弯叶米仔兰（Aglaia cucullata）根中的发现：肖尔酸（shoreic acid）通过多靶点机制抗肺癌的分子对接与网络药理学研究

《Applied Biological Chemistry》：Dammarane-type triterpenoids from the roots of Aglaia cucullata: mechanistic insights into the multitarget activity of shoreic acid in lung cancer

　　

尽管从弯叶米仔兰（Aglaia cucullata）中已报道的达玛烷型三萜类化合物具有细胞毒活性潜力，但该物种的根部仍鲜有研究。因此，本研究旨在从印度尼西亚产弯叶米仔兰的根中分离达玛烷衍生的三萜类化合物，评估其对A549肺癌细胞的细胞毒活性，并利用网络药理学和分子对接技术探讨活性最强化合物的潜在抗非小细胞肺癌（anti-NSCLC）机制。研究人员将根提取物通过色谱法进行分级和纯化，获得纯化合物（1–5），其结构通过高分辨飞行时间质谱（HR-TOF-MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振波谱（NMR）确定，并与既往研究进行比较。采用MTT法评估所有分离化合物对A549细胞的细胞毒活性。利用网络药理学识别潜在的分子靶点和信号通路，随后通过分子对接预测活性最强化合物与选定靶蛋白的结合相互作用。此外，共分离得到五种已知的达玛烷骨架衍生的三萜类化合物，即卡巴拉内酯（cabralealactone，1，一种C27三去甲达玛烷型γ-内酯）、卡巴拉酮（cabraleone，2）和奥科蒂隆（ocotillone，3，均为达玛烷型三萜），以及艾希勒酸（eichlerianic acid，4）和肖尔酸（shoreic acid，5，均为开环达玛烷衍生物）。在分离的化合物中，化合物5系首次从弯叶米仔兰中报道，其对A549细胞的细胞毒活性（半数抑制浓度IC50 = 123.05 μM）相对于化合物1–4较弱。网络药理学确定了与NSCLC相关的若干潜在靶点和信号通路，而分子对接预测了化合物5与选定靶点之间的有利相互作用。结果表明，肖尔酸（5）作为一种多靶点调节骨架，有待进一步研究。本研究报道了弯叶米仔兰根部作为具有生物活性的达玛烷型三萜类化合物的来源。

论文解读

一、研究背景与意义

楝科（Meliaceae）植物被公认为结构多样的次生代谢产物的重要来源，广泛分布于亚洲、非洲和美洲等热带及亚热带地区。从该科植物中分离得到的三萜类、甾体类、黄酮类、木脂素类、黄酮生物碱类及含氮化合物等，表现出显著的抗癌、抗菌和抗炎等生物活性。在楝科众多属中，米仔兰属（Aglaia）因其显著的化学多样性和生物活性而备受关注。达玛烷型三萜是该属植物中一类重要的三萜化合物，其结构特征在于A环3位和4位之间发生断裂形成开环结构，该开环结构上含有羧基、酯基、双键或羟基等多种官能团。既往研究表明，从假马齿苋（Bacopa monnieri）中分离的达玛烷型三萜苷类具有改善记忆的潜力，而达玛烷型三萜皂苷则表现出良好的抗抑郁活性以及对HepG2、NCI-H460和MCF-7等多种癌细胞系的显著抑制活性。

此前对弯叶米仔兰的植物化学研究主要集中于茎皮和外果皮部位，已报道存在多种达玛烷型三萜类化合物，其中部分化合物对多种癌细胞系表现出细胞毒活性。然而，对印度尼西亚产弯叶米仔兰根部的植物化学研究仍然有限。植物不同部位会影响代谢产物的组成和生物活性，提示弯叶米仔兰根部可能含有独特或尚未充分开发的新型生物活性成分。

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）因其高发病率和复杂的分子机制，仍然是癌症相关死亡的主要原因之一。近年来，网络药理学被报道为研究生物活性化合物多靶点相互作用的强大工具，能够从系统层面理解其作用机制。该方法与分子对接分析相结合，可预测与疾病通路相关的关键蛋白靶点及其结合相互作用。因此，本研究旨在通过对印度尼西亚产弯叶米仔兰根部进行植物化学分离与结构鉴定，评估分离化合物对A549肺癌细胞的细胞毒活性，并利用网络药理学和分子对接分析探讨活性最强化合物的潜在抗NSCLC机制。

二、主要研究技术方法

研究人员采用多种关键技术方法开展本研究。首先，将约6.7 kg风干的弯叶米仔兰根部粉末以70%乙醇室温浸提，获得粗提物545 g，依次经正己烷、乙酸乙酯和正丁醇液-液分配萃取后，对正己烷萃取物（47.2 g）采用减压液相色谱、正相硅胶柱色谱和反相柱色谱等多种色谱技术进行分离纯化，获得5个纯化合物。化合物结构通过高分辨飞行时间质谱（HR-TOF-MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振波谱（NMR，700 MHz ¹H-NMR和175 MHz ¹³C-NMR）确定。细胞毒活性采用MTT法评估，以顺铂（cisplatin）为阳性对照。网络药理学分析中，利用SwissTargetPrediction数据库预测肖尔酸的潜在靶基因，从GeneCards、OMIM和TTD数据库获取NSCLC相关靶基因，通过Venn分析确定交集靶点，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过Cytoscape的CytoHubba插件进行关键靶点识别，采用ShinyGo进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。分子对接采用DockingPie插件中的RxDock、AutoDock Vina和Smina三种程序进行一致性对接（consensus docking），通过Rank by Rank（RbR）、Average of Auto-Scaled Scores（AASS）和Z-score三种方法进行一致性评分。

三、研究结果

结构鉴定

从弯叶米仔兰根部正己烷提取物中分离得到5个已知的达玛烷型三萜类化合物。化合物1为无色晶体，分子式C₂₇H₄₂O₃，具有27个碳信号，包括一个酯羰基和一个酮羰基，为C₂₇三去甲达玛烷型γ-内酯，鉴定为卡巴拉内酯（cabralealactone）。化合物2为无色晶体，分子式C₃₀H₅₀O₃，含有20,24-环氧达玛烷骨架（艾希勒型，20S,24S），鉴定为卡巴拉酮（cabraleone）。化合物3与化合物2为差向异构体，具有20,24-环氧达玛烷骨架（肖尔型，20S,24R），鉴定为奥科蒂隆（ocotillone）。化合物4为白色晶体，分子式C₃₀H₅₀O₄，为开环达玛烷衍生物，含有羧酸羰基和末端亚甲基，侧链构型为20S,24S，鉴定为艾希勒酸（eichlerianic acid）。化合物5为白色无定形粉末，与化合物4为C-24位差向异构体（24R），鉴定为肖尔酸（shoreic acid），系首次从弯叶米仔兰中报道。

结构-细胞毒活性关系

MTT法评估结果显示，肖尔酸（5）的细胞毒活性相对最强，IC₅₀ = 123.05 μM，但该值属于体外筛选中的弱细胞毒活性范围。其活性归因于侧链上羧酸和羟基的存在，这些极性基团增强了与生物大分子之间的氢键和静电相互作用。艾希勒酸（4）含有酸性基团但活性较弱，与侧链取代基位置和立体化学取向的差异有关。奥科蒂隆、卡巴拉酮和卡巴拉内酯的细胞毒活性较低，因其极性官能团较少且具有较刚性的环状侧链，限制了与生物靶点的有效相互作用。

网络药理学

从GeneCards、OMIM和TTD数据库共获得8,198个NSCLC相关靶基因，从SwissTargetPrediction数据库预测获得97个肖尔酸潜在靶基因，Venn分析确定81个重叠靶基因。PPI网络分析结合CytoHubba的Degree、EPC、MCC和MNC四种拓扑算法，一致识别出STAT3、EP300、ESR1、RELA、HSP90AA1、NR3C1、PGR、AR、STAT1和PPARG等关键基因。GO和KEGG富集分析聚焦于“癌症通路”，最终确定STAT3、PPARG、HSP90AA1、EP300和AR五个关键蛋白为肖尔酸在NSCLC中的潜在靶点。

一致性分子对接

共结晶配体重新对接验证显示，大多数靶蛋白的RMSD值低于2 ?，表明对接方案可靠。肖尔酸对所有靶蛋白的结合能均低于?4.0 kcal/mol，其中对HSP90AA1（PDB ID：3O0I）的结合能为?8.5至?8.8 kcal/mol，强于天然配体ATP（?7.3至?7.7 kcal/mol）；对EP300（PDB ID：8GZC）的结合能为?9.3至?9.5 kcal/mol，接近?10 kcal/mol，表明存在非常强的特异性结合；对STAT3（PDB ID：6NJS）的结合能为?5.8至?6.1 kcal/mol，为中等亲和力；对PPARG（PDB ID：6TSG）的结合能为?5.3至?5.8 kcal/mol，与天然配体花生四烯酸（?6.4至?6.0 kcal/mol）相当；对AR的结合能较弱（?2.5至?2.6 kcal/mol）。一致性评分中，RbR值接近1，AASS值接近零，Z-score均为负值（?1.016至?3.243），表明各对接程序选出的结合构象高度一致且质量优于平均分布。

四、讨论与结论

分子对接结果揭示了肖尔酸与各靶蛋白的具体相互作用模式。对于STAT3，肖尔酸通过三个重要氢键（与Gln635、Glu625和Tyr657残基）以及疏水相互作用（与Ile659和Trp623残基）稳定结合于SH2结构域，阻断STAT3与细胞因子受体的结合，阻止其核转位、磷酸化和同源二聚化，从而抑制下游调控癌细胞增殖和存活相关基因的转录。对于PPARG，肖尔酸与Arg288、Ser342和Glu343残基形成常规氢键，并与Cys285和Ile341产生疏水接触，其中Arg288和Ile341与天然配体花生四烯酸的结合残基重合，提示肖尔酸可能作为竞争性抑制剂阻断花生四烯酸对PPARG的激活。对于HSP90AA1，肖尔酸与关键残基Tyr139形成典型氢键，并被Val150、Leu107、Phe138和Met98等残基包围的密集疏水接触网络所稳定，且不像ATP那样在Asp93处存在不利的冲突供体相互作用，因此是极具吸引力的HSP90AA1抑制剂候选分子。对于EP300，肖尔酸直接与活性残基Gln1455和Ser1400相互作用，并通过与Arg1410和Leu1的疏水接触进一步稳定。

本研究从印度尼西亚产弯叶米仔兰根部中分离并鉴定了5个达玛烷型三萜类化合物，其中肖尔酸为首次从该物种中报道。肖尔酸对A549细胞表现出弱细胞毒活性，但网络药理学和分子对接分析表明其具有多靶点调节潜力，可能通过作用于STAT3、PPARG、HSP90AA1、EP300和AR等多个靶点发挥抗NSCLC作用。该研究为弯叶米仔兰根部作为生物活性达玛烷型三萜类化合物的来源提供了新的证据，肖尔酸作为多靶点调节骨架有待进一步深入研究，后续需通过不同的体外功能实验验证其机制效应。