《Journal of Bacteriology》：PBP1A and LdtJ transpeptidase activities are crucial for cell envelope homeostasis and counteract the selection of colistin resistance in Acinetobacter baumannii
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鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的多层细胞包膜是维持细胞完整性并保护细菌免受外部应激和抗生素影响的关键结构。该包膜由内膜、薄层肽聚糖（peptidoglycan，PG）和非对称外膜（outer membrane，OM）组成，其中外
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的多层细胞包膜是维持细胞完整性并保护细菌免受外部应激和抗生素影响的关键结构。该包膜由内膜、薄层肽聚糖（peptidoglycan，PG）和非对称外膜（outer membrane，OM）组成，其中外膜富含脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS），其脂质A部分是多黏菌素（colistin，一种最后防线抗生素）的作用靶点。尽管脂质A在大多数革兰阴性菌中是必需的，但鲍曼不动杆菌可通过包膜重塑在缺乏LOS的条件下存活，尤其是在产生低水平双功能青霉素结合蛋白PBP1A（由mrcA基因编码）的菌株或ΔmrcA突变体中。本研究揭示了生成3-3交联的LD-转肽酶LdtJ与在PG合成中催化4-3转肽反应的PBP1A之间存在遗传和功能上的相互作用。研究表明，同时失活这两种酶会严重影响生长、活菌数、形态和外膜稳态。PG分析显示，ΔldtJ ΔmrcA双突变体表现出总体交联度降低和聚糖链缩短，与削弱了的囊状体（sacculus）一致。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验证明PBP1A与LdtJ存在关联，提示这两种蛋白可能在PG合成过程中于邻近位置发挥作用。值得注意的是，与野生型和单突变体相比，ΔldtJ ΔmrcA双突变体表现出最高的多黏菌素耐药、LOS缺陷型变体的恢复频率。综上所述，研究结果表明4-3和3-3转肽酶活性在PG合成和重塑中发挥互补作用，有助于维持鲍曼不动杆菌的包膜稳定性，而这些活性的破坏有利于多黏菌素耐药性的出现。该工作进一步强调了PG重塑在维持包膜稳态中的重要性，并提示适当的PG交联作为一种生理约束，可限制鲍曼不动杆菌中LOS缺陷型多黏菌素耐药变体的出现，为理解导致包膜失稳的机制提供了新见解。
论文解读
一、研究背景与科学问题
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是医疗环境中备受关注的条件致病菌，以其在环境应激下存活和抵抗多类抗生素的能力著称，包括多黏菌素（colistin）这类最后防线药物。这种抵抗力在很大程度上依赖于细胞包膜的结构和功能完整性。革兰阴性菌的细胞包膜由内膜、肽聚糖（peptidoglycan，PG）层和外膜（outer membrane，OM）三部分组成。在鲍曼不动杆菌中，外膜富含脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS），其脂质A部分是多黏菌素的靶点。尽管脂质A在大多数革兰阴性菌中是必需的，鲍曼不动杆菌却能在LOS缺失的情况下存活，这依赖于包膜重塑机制。
在PG合成方面，鲍曼不动杆菌中4-3交联由青霉素结合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）催化，而该物种唯一的LD-转肽酶LdtJ催化3-3交联。已有研究表明，LdtJ介导的交联常在PG结构受到扰动时发挥补偿作用以维持包膜功能。然而，DD-转肽酶和LD-转肽酶在鲍曼不动杆菌PG合成与重塑过程中如何功能性地相互作用，此前尚不清楚。此前研究曾提出mrcA与ldtJ之间存在合成致死关系，暗示当PBP1A依赖的4-3交联缺失时，LdtJ介导的3-3交联变得不可或缺，但这一假设缺乏直接验证。因此，阐明这两种转肽酶活性之间的功能关系及其对包膜稳态和抗生素耐药性选择的影响，具有重要的科学意义和临床价值。
二、研究内容与主要结论
研究人员在多重耐药（multidrug-resistant，MDR）临床分离株AB5075和实验室菌株ATCC 17978中构建了ldtJ和mrcA的单突变及双突变体，系统考察了这些突变对生长、活菌数、细胞形态、外膜稳定性、PG结构以及多黏菌素耐药变体出现频率的影响。研究发现，ldtJ与mrcA双突变体并非如先前假设的那样合成致死，而是可存活但表现出严重的生长缺陷、明显的形态异常和受损的包膜稳态。PG组成分析揭示了双突变体中总体交联度显著降低和聚糖链缩短，从分子层面解释了观察到的表型缺陷。免疫共沉淀实验证明PBP1A与LdtJ在体内存在蛋白关联，提示二者可能在PG合成位点协同作用。此外，双突变体表现出最高的多黏菌素耐药、LOS缺陷型变体恢复频率，表明PG交联的破坏为LOS缺失型耐药变体的出现创造了有利的生理条件。这些发现揭示了4-3和3-3转肽酶活性在维持鲍曼不动杆菌包膜稳态中的互补作用，为理解PG结构扰动如何影响抗生素耐药性提供了新视角。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：利用AB5075转座子突变文库和基于Cre重组及自然转化的两步法构建双突变体，并通过全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）验证突变背景；采用HADA（7-hydroxycoumarin-carbonylamino-D-alanine）荧光标记结合显微镜技术观察PG合成位点和细胞形态；通过高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）和质谱联用分析PG组成和交联特征；利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）结合免疫印迹验证蛋白间相互作用；通过菌落斑点试验评估外膜通透性和完整性；采用LOS凝胶染色和E-test法鉴定多黏菌素耐药LOS缺陷型变体并测定最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
四、研究结果
同时缺失ldtJ与mrcA（而非mrcB）影响生长、活菌数和细胞形态。 在AB5075中，单缺失ldtJ或mrcA不造成显著生长缺陷，而ΔldtJ ΔmrcA双突变体虽可存活但生长受损、活菌数降低。形态学分析显示双突变体细胞显著延长且变窄，表现出比ΔmrcA单突变体更严重的形态异常。HADA标记实验表明，ΔldtJ和ΔldtJ ΔmrcA突变体的HADA掺入显著减少，与LdtJ功能受损一致。相比之下，ΔldtJ ΔmrcB双突变体在生长和HADA掺入方面与野生型相似。在ATCC 17978背景中也观察到类似的双突变体表型。回补实验显示，单独表达ldtJ可恢复HADA掺入但不能挽救形态缺陷，而单独表达mrcA可恢复形态但不能恢复HADA掺入，表明两种酶对维持PG结构具有非冗余贡献。
LdtJ与PBP1A双重失活影响外膜稳定性与完整性。 在利福平（rifampin）、SDS及SDS/EDTA胁迫条件下，ΔldtJ ΔmrcA双突变体表现出高达4个数量级的生长抑制，提示外膜通透性增加和完整性丧失。回补实验证实，异位表达LdtJ或PBP1A均可部分或完全恢复双突变体在利福平存在下的生长能力，其中PBP1A的恢复效果更为显著，表明两种酶对外膜稳定性具有非冗余的贡献。
LdtJ与PBP1A同时失活重塑肽聚糖结构。 HPLC和质谱分析显示，ΔldtJ突变体几乎完全丧失3-3交联，而ΔmrcA突变体的3-3交联略有增加，提示在PBP1A缺失时LdtJ活性升高。相应地，ΔldtJ突变体中4-3交联增加，表明PBP1A活性在LdtJ缺失时增强。双突变体则表现出总体交联度显著降低，且脱水（anhydro）胞壁肽水平升高，指示聚糖链缩短和PG网络碎片化。这些结果说明LdtJ和PBP1A在PG交联中具有互补作用，其同时缺失产生结构削弱的囊状体。
Co-IP揭示PBP1A与LdtJ在体内存在关联。 在ATCC 17978野生型和ΔmrcA突变体中表达LdtJ-FLAG融合蛋白，免疫沉淀后检测到PBP1A与之共沉淀；反向实验中，PBP1A-FLAG的免疫沉淀也回收了LdtJ。对照蛋白RpoA未检出，证实了相互作用的特异性。这一发现提示PBP1A和LdtJ可能在同一蛋白复合物中于PG合成活跃位点协同发挥功能。
ΔldtJ ΔmrcA突变体中LOS缺陷型多黏菌素耐药变体的恢复频率呈加性增加。 AB5075野生型的ColR LOS?变体恢复频率为6.3×10?1?，ΔldtJ和ΔmrcA单突变体分别增至6.9×10??和4.9×10??，而ΔldtJ ΔmrcA双突变体达到最高的1.07×10??。ΔldtJ ΔmrcB双突变体则未恢复出ColR LOS?变体。在ATCC 17978背景中，双突变体的恢复频率也相对升高。SDS-PAGE分析确认分离的ColR变体缺乏可检测的LOS。这些变体对多黏菌素耐药但对万古霉素等外膜低渗透性抗生素变得敏感，且在无药条件下表现出细胞聚集和气球样形态异常，而在多黏菌素存在下这些异常减轻。
五、讨论与结论
讨论部分指出，与大肠杆菌（Escherichia coli）拥有六个LDTs且PBP1A与PBP1B可完全互补不同，鲍曼不动杆菌仅依赖LdtJ合成3-3交联，且PBP1B虽能在PBP1A缺失时维持生存，但无法完全补偿PBP1A缺失相关的表型缺陷。研究提出LdtJ与PBP1A可能在同一个复合物中协同工作以优化PG合成、成熟和重塑；当一种酶失活时，另一种可部分补偿，但同时失活则导致严重的PG结构和包膜完整性缺陷。研究还讨论了PBP1A与LdtJ的体内关联可能类似于大肠杆菌中LdtD与PBP1B的相互作用，后者在OM组装受损时通过加固囊状体防止细胞裂解。
研究结论表明，LdtJ和PBP1A在PG合成、成熟和重塑与OM稳定性之间建立了互补的偶联关系。4-3和3-3交联的均衡合成确保了囊状体的机械强度和灵活性，从而维持外膜屏障功能。破坏这种平衡会损害包膜稳态，并创造有利于通过LOS缺失选择多黏菌素耐药性的生理条件。该研究确定了PBP1A-LdtJ轴作为包膜稳态的关键决定因素，为理解PG结构扰动如何影响抗生素耐药性提供了新见解，并提示这一系统可作为靶向多重耐药鲍曼不动杆菌包膜失稳策略的潜在靶点。
