《Veterinary Sciences》：Identification of a Pseudomonas putida-like Strain and Its Association with the Immune Response in Hybrid Sturgeon (Huso dauricus × Acipenser schrenckii)
编辑推荐：
本研究鉴定了一种类恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida-like）菌株，并将其确定为患病杂交鲟（Huso dauricus × Acipenser schrenckii）的潜在病原体。感染该类恶臭假单胞菌与宿主免疫应答的变化、肠道群落结构的改变趋
本研究鉴定了一种类恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida-like）菌株，并将其确定为患病杂交鲟（Huso dauricus × Acipenser schrenckii）的潜在病原体。感染该类恶臭假单胞菌与宿主免疫应答的变化、肠道群落结构的改变趋势以及血清生化参数的改变相关。这些数据为杂交鲟养殖疾病的预防提供了有价值的见解。
简单摘要：恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种条件致病菌，可影响多种水生动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。然而，关于鲟鱼感染恶臭假单胞菌后免疫应答的研究仍然有限。在本研究中，研究人员从患病的杂交鲟（Huso dauricus × Acipenser schrenckii）体内分离并鉴定了一种类恶臭假单胞菌菌株（YFI-327）。首先，分析了该菌的形态学、理化特性以及16s rRNA和g yrB基因序列。随后，组织病理学分析显示，患病杂交鲟的肝脏、脾脏、肠道和鳃出现广泛坏死。对感染类恶臭假单胞菌菌株的杂交鲟脾脏样本进行转录组分析，共发现3337个差异表达基因（DEGs），包括2161个上调基因和1176个下调基因。差异表达基因分析表明，抗原加工与呈递通路、造血细胞谱系通路和NOD样受体信号通路的84个关键组分上调，而补体与凝血级联通路的20个关键组分下调，这表明这些通路可能参与了针对类恶臭假单胞菌感染的应答。此外，肠道微生物群结果显示，感染后肠道菌群的丰富度和多样性呈增加趋势，同时优势微生物在门水平上从厚壁菌门（Firmicutes）转变为变形菌门（Proteobacteria），在属水平上从Candidatus arthromitus转变为Xylophilus。结果还显示，感染类恶臭假单胞菌后血清生化参数发生改变。这些结果证明，该类恶臭假单胞菌菌株是杂交鲟的一种潜在病原体，其感染可能对鲟鱼养殖构成严重威胁。
研究背景与目的
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是一种广泛分布于环境中的条件致病菌，可感染鱼类、两栖类和爬行类等多种水生动物，导致皮肤溃疡和肠炎等疾病。杂交鲟（Huso dauricus × Acipenser schrenckii）是中国主要养殖的鲟鱼品种，具有生长快、抗病性强和经济价值高等特点。然而，随着高密度养殖、水质恶化等因素，近年来鲟鱼病害爆发日益频繁，多种细菌性病原已被报道。尽管已有研究揭示恶臭假单胞菌可诱导大菱鲆的细胞凋亡和组织损伤并触发免疫应答，但鲟鱼对该菌的防御机制尚不清楚。因此，本研究旨在从患病杂交鲟中分离并鉴定潜在的病原菌，通过转录组分析、肠道微生物群分析和血清生化分析，系统探究类恶臭假单胞菌感染对杂交鲟免疫应答的影响，为鲟鱼养殖疾病的防控提供理论依据。
主要技术方法
- 1.
病原菌分离与鉴定：从湖北省宜昌市患病杂交鲟的脾脏和肝脏组织中分离纯化获得菌株YFI-327。采用革兰氏染色观察形态，利用Biology自动微生物鉴定系统（BAMIS）进行生理生化分析。通过PCR扩增16S rRNA和g yrB基因并进行测序，基于邻接法构建系统发育树以确定分类地位。
- 2.
人工感染实验与半数致死剂量（LD50）测定：将不同浓度梯度的YFI-327菌液腹腔注射健康杂交鲟，连续记录14天死亡率，采用Karber法计算LD50。
- 3.
组织病理学分析：对自然患病杂交鲟的肝脏、脾脏、肠道和鳃组织进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察病理变化。
- 4.
转录组分析：以LD50剂量腹腔注射感染杂交鲟，于感染后3天采集脾脏，提取总RNA后进行DNBSEQ-T7平台测序。经质控、比对参考基因组后，以FDR≤0.05且|log2fc|≥1为标准筛选差异表达基因（DEGs），并进行GO功能和KEGG通路富集分析。选取8个关键基因通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证转录组结果。
- 5.
肠道微生物群分析：于感染后3天采集肠道黏膜附着菌群，提取DNA后扩增16S rRNA基因V3-V4区，采用Illumina MiSeq PE300平台测序，通过QIIME2流程进行ASV聚类、α多样性和β多样性分析以及物种组成分析。
- 6.
血清生化分析：于感染后0、1、3天采集血液，分离血清后检测抗氧化酶活性（T-SOD、CAT）、氧化产物（MDA）、非特异性免疫因子（GSH、ACP、ALP）、肝损伤标志物（AST、ALT、AST/ALT）、组织损伤标志物（LDH、CK）及营养代谢指标（TP、ALB）。
研究结果
3.1 临床症状：自然患病杂交鲟表现为精神萎靡、反应迟钝、游动缓慢和食欲废绝，死亡率约70%。病鱼下颌、泄殖腔和骨板出血，解剖可见胆囊肿大、肠道空虚、肝脏苍白且伴有出血点。上述病变在84.8%的病鱼中观察到。
3.2 菌株的形态、理化、16S rRNA和g yrB特征：YFI-327菌落在BHI平板上呈淡黄色、半透明、圆形、隆起、边缘完整。革兰氏染色阴性，菌体杆状，长2-4μm、宽0.3-0.4μm。BAMIS系统鉴定为类恶臭假单胞菌。16S rRNA和g yrB基因系统发育树显示，YFI-327与恶臭假单胞菌聚为一支，结合形态和理化结果确认其为类恶臭假单胞菌。
3.3 组织病理学变化：患病鱼肝脏出现广泛坏死、炎性细胞浸润、肝血窦扩张和黑色素巨噬细胞中心增多。脾脏红髓和白髓分界不清，出现坏死灶、炎性病变和随机分布的黑色素巨噬细胞中心。鳃呈现次级鳃瓣卷曲、上皮细胞肿胀、初级鳃瓣充血伴黑色素巨噬细胞中心。肠道黏膜下层多处出血，肌层炎性细胞浸润，浆膜层出现黑色素巨噬细胞中心。
3.4 LD50检测：YFI-327菌株感染后，死亡率呈剂量依赖性升高。最高剂量组于2天开始死亡，7天累积死亡率达100%；最低剂量组于5天开始死亡，10天死亡率为15.6%。经计算，LD50为2.1×105 CFU/尾。濒死和死亡鱼表现出与自然感染相似的临床症状，且重新分离的菌株经鉴定确认为类恶臭假单胞菌。
3.5 转录组分析与验证：感染组与对照组相比共鉴定出3337个DEGs，其中2161个上调、1176个下调。GO富集分析显示DEGs显著富集于免疫系统过程、免疫应答、白细胞迁移、生物刺激应答和髓系白细胞迁移等条目。KEGG富集分析表明，抗原加工与呈递通路（37/133个基因为DEGs，32个上调、5个下调）、造血细胞谱系通路、补体与凝血级联通路（20个下调、8个上调）和NOD样受体信号通路（14.6%的基因为DEGs）显著富集。qRT-PCR验证了ifnγ、irf3、hsp90、mhc Ia、mhc IIa、il-1β、il-8和c1q八个基因的表达趋势与转录组一致。
3.6 微生物组成：感染组肠道菌群的Chao1、Shannon和Simpson指数均高于对照组，但未达到统计学显著性。感染组ASV数量（1518个）远高于对照组（245个），共享149个ASV。主坐标分析显示两组肠道微生物群落呈分离趋势。在门水平，感染组变形菌门（Proteobacteria）相对丰度从20.22%升至68.69%，厚壁菌门（Firmicutes）从74.86%降至2.94%。在属水平，Candidatus arthromitus从74.8%降至0.87%，而Xylophilus从5.04%升至17.53%，Afipia、Mycobacterium和Asinibacterium也显著增加。
3.7 血清生化分析：感染后3天，T-SOD、CAT活性及MDA、GSH、LDH、TP浓度较对照组升高。ACP活性持续升高。CK活性和AST水平逐渐下降。ALT活性在1天升高后于3天恢复至对照水平。AST/ALT比值持续降低。ALP活性和ALB浓度先降后升，在3天高于对照组。
讨论与结论
讨论部分总结：YFI-327菌株的形态、生化特征及系统发育分析证实其为类恶臭假单胞菌。临床和解剖症状与其他鱼类感染恶臭假单胞菌的报告部分相似，但未观察到体表溃疡和腹水。组织病理学显示的严重炎症、坏死及黑色素巨噬细胞中心增多，与细菌入侵和免疫应答激活有关。转录组分析揭示抗原加工与呈递通路、NOD样受体信号通路等免疫相关通路被显著激活，其中mhc I和mhc II基因上调提示MHC分子参与鲟鱼抗细菌免疫应答，而hsp90的表达模式因病原种类而异。补体与凝血级联通路中多数关键组分下调，暗示补体系统功能可能受到抑制，这与爱德华氏菌和耶尔森氏菌感染的结果相似，但与嗜水气单胞菌感染不同。肠道微生物群分析显示感染后菌群多样性增加，优势菌门由厚壁菌门转为变形菌门，表明类恶臭假单胞菌感染与肠道微生态失调相关。血清生化参数的变化反映了抗氧化系统激活、组织损伤和肝脏功能改变。
结论部分翻译：总之，研究人员分离并鉴定了一株新的类恶臭假单胞菌（YFI-327），该菌与疾病相关，是杂交鲟（Huso dauricus × Acipenser schrenckii）的一种潜在病原体。多个宿主免疫通路，主要包括抗原加工与呈递通路、造血细胞谱系通路、NOD样受体信号通路以及补体与凝血级联通路，参与了针对YFI-327感染的应答。感染伴随肠道微生物群组成的改变趋势。此外，与组织改变和全身抗氧化能力相关的血清生化参数在YFI-327攻毒后发生了改变。这些数据为鲟鱼应对类恶臭假单胞菌感染的应答机制提供了新的见解。
