绵羊布鲁氏菌病五种血清学方法的比较评估：血清反应阳性样本的一致性与分子确认

《Veterinary Sciences》：Comparative Evaluation of Five Serological Methods for the Diagnosis of Ovine Brucellosis: Agreement and Molecular Confirmation of Seroreactive Samples

　　

中文翻译摘要 这项横断面研究比较了五种用于绵羊布鲁氏菌病的血清学方法——虎红平板凝集试验（Rose Bengal test, RBT）、试管凝集试验（agglutination test, AT）、补体结合试验（complement fixation test, CFT）、赛杜尔丁试验（Saiduldin test, ST）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）——研究对象为来自哈萨克斯坦阿拉木图州伊利区四个乡村地区的575只绵羊。所有样本均接受了这五种方法的检测，而聚合酶链式反应（PCR）仅对至少一种血清学试验呈阳性的样本进行。在575只动物中，有40只（6.96%）获得了至少一项阳性结果。各方法的阳性结果频率分别为：ST为6.61%，ELISA为6.43%，RBT和CFT均为3.30%，AT为1.57%。最高的成对一致性出现在RBT与CFT之间（κ = 0.946）以及ST与ELISA之间（κ = 0.929）。在40份血清反应阳性样本中，有8份检测到布鲁氏菌属（Brucella spp.）DNA；这8份样本在所有五种血清学方法中均为阳性。在PCR阳性的ST阳性样本中，其中位数滴度高于PCR阴性的ST阳性样本（中位数1:80对比1:10；p = 0.002）。由于PCR仅限于血清反应阳性样本，且缺乏独立的参考标准，因此无法估算诊断敏感性、特异性及预测值。

论文解读文章

研究背景与目的

布鲁氏菌病是一种对畜牧业经济和公共卫生都具有重要意义的人畜共患传染病，尤其在小反刍动物中，其病原体主要为马耳他布鲁氏菌（Brucella melitensis）。在哈萨克斯坦，该病持续流行，近期分子流行病学研究也证实了布鲁氏菌在该国牲畜中的持续传播。实验室诊断依赖于直接分离病原体和间接血清学方法，后者因其简便性而被大规模应用于监测。然而，不同血清学方法基于不同的原理，可能识别出不同的动物群体作为血清反应阳性者，导致结果不完全一致。这种不一致性给疫情判断和防控决策带来了挑战。因此，在同一动物群体中平行比较多种血清学方法，评估它们之间的一致性程度，并结合分子检测手段进行分析，对于优化布鲁氏菌病的实验室诊断策略具有重要意义。本研究旨在比较五种血清学方法——虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（AT）、补体结合试验（CFT）、赛杜尔丁试验（ST）和酶联免疫吸附试验（ELISA）——在哈萨克斯坦阿拉木图州田间条件下的应用效果，评估其结果间的一致性与重叠模式，并对至少一种血清学试验阳性的样本进行聚合酶链式反应（PCR）分子检测。

研究方法与技术

研究人员采用横断面研究设计，于2015至2016年间收集了来自哈萨克斯坦阿拉木图州伊利区四个乡村地区（Karoy、Kurty、Ashybulak和Mezhdurechensk）共计575只绵羊的血清样本。这些样本来源于常规国家兽医监测计划，并非专门为本研究招募。所有575份血清样本均平行接受了五种血清学方法的检测：定性检测的RBT、定量检测的AT和CFT、基于凝集现象的ST以及间接ELISA。仅对至少一种血清学方法结果为阳性的40份样本进行了分子检测，使用的是针对布鲁氏菌属（Brucella spp.）DNA的商品化PCR检测试剂盒。统计分析包括计算阳性率、使用Cochran's Q检验比较总体差异、McNemar检验进行两两比较（经Holm法校正）、Cohen's kappa系数评估一致性，以及Fisher精确检验和Mann-Whitney U检验分析亚组关联。

研究结果

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  血清学阳性结果的频率：在575只动物中，40只（6.96%）至少在一项血清学检测中呈阳性。ST和ELISA的阳性率最高（分别为6.61%和6.43%），RBT和CFT次之（均为3.30%），AT最低（1.57%）。Cochran's Q检验显示五种方法间的阳性率存在统计学显著差异。
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  血清学结果的地区分布：描述性数据显示，Karoy地区血清反应阳性比例最高（10.95%），其次是Kurty（5.41%）、Ashybulak（4.62%）和Mezhdurechensk（2.00%）。探索性分析提示复合血清反应性在不同地区间可能存在差异，但由于缺乏畜群层面信息，该结果应视为描述性而非确证性证据。
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  血清学方法间的成对一致性：最高的Cohen's kappa值出现在RBT与CFT之间（κ = 0.946）以及ST与ELISA之间（κ = 0.929），表明这两对方法的结果几乎完全一致。RBT与ST、RBT与ELISA、CFT与ST以及CFT与ELISA之间的kappa值范围为0.651至0.664，属于较高的一致性。AT与其他方法的一致性较低，特别是与ST（κ = 0.367）和ELISA（κ = 0.376）。
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  血清学结果的重叠结构：在40只血清反应阳性动物中，共观察到7种不同的阳性组合模式。最常见的是仅ST和ELISA阳性（15/40，37.5%）。其次分别是RBT、CFT、ST和ELISA同时阳性（9/40）以及全部五种方法均阳性（9/40）。所有AT阳性样本均属于全部五种方法均阳性的组合。
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  血清学结果与PCR的比较：在40份血清反应阳性样本中，有8份（20.0%）检测到布鲁氏菌DNA。值得注意的是，这8份PCR阳性样本全部来自那9只全部五种血清学方法均呈阳性的动物。在其余31只仅在一到四种测试中呈阳性的动物中，未检出布鲁氏菌DNA。这一差异具有统计学显著性（Fisher精确检验，p < 0.001）。
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  血清学阳性测试数量与PCR结果的关联：全部五种血清学方法均阳性的9只动物中，有8只（88.9%）PCR阳性。而在仅一至四种测试阳性的31只动物中，PCR阳性率为0%。
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  血清学滴度与PCR结果的比较：在ST中，PCR阳性样本的中位数滴度（1:80）显著高于PCR阴性样本（1:10）（p = 0.002）。而CFT和ELISA的滴度在两组间无统计学显著差异。

结论与讨论

本研究的核心发现是，五种血清学方法在同一绵羊群体中产生了显著不同的阳性率，并且呈现出一致性和重叠性各异的结构。RBT与CFT之间以及ST与ELISA之间表现出极高的一致性。更重要的是，所有PCR阳性样本均来自那些在全部五种血清学方法中均呈阳性的动物亚群，这表明高度一致的血清学反应与血液中可检测到的布鲁氏菌DNA之间存在强关联。虽然ST与ELISA高度一致并能识别出更多血清反应阳性个体，但这些额外识别的个体并未得到PCR的分子确认。相反，ST滴度与PCR阳性结果存在关联。研究指出，由于PCR仅在血清反应阳性样本中进行，且缺乏独立的感染状态参考标准（如细菌分离培养），因此无法计算各血清学方法的诊断敏感性和特异性。此外，疫苗免疫史等关键信息的缺失限制了将血清反应归因于自然感染的确定性。研究结论强调，ST作为一种辅助血清学方法值得进一步独立验证，但不应将其与ELISA的高一致性视为诊断性能更优的证据。最终评价需要采用前瞻性设计，对所有动物（无论血清学结果如何）进行分子和细菌学检测，以确定其真实的诊断效能。