《Journal of Cardiovascular Development and Disease》：Proteomics Reveal SERPINF1 and PCOLCE Dysregulation During Cardiac Outflow Tract Development in Adamts5?/? Mice
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约2.5%的成年人患有主动脉瓣疾病（aortic valve disease, AVD），该疾病常伴有升主动脉（ascending aortic artery, AscAo）畸形（主动脉病）。尽管AVD患病率高且病情严重，但目前尚无针对AVD的药物治疗手段。为
约2.5%的成年人患有主动脉瓣疾病（aortic valve disease, AVD），该疾病常伴有升主动脉（ascending aortic artery, AscAo）畸形（主动脉病）。尽管AVD患病率高且病情严重，但目前尚无针对AVD的药物治疗手段。为鉴定参与AVD的新型因子，研究人员对心脏流出道（cardiac outflow tracts, OFTs）裂解物进行了基于液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）的无标记蛋白质组学分析，OFTs是主动脉瓣和升主动脉的发育前体结构。研究人员在细胞外基质（extracellular matrix, ECM）蛋白聚糖酶ADAMTS5（A Disintegrin and Metalloprotease with ThromboSpondin repeats 5）缺陷小鼠（n = 7）的OFT中鉴定出232个差异表达蛋白，该小鼠模型表现出完全外显的AVD和主动脉病，并伴有过量聚集性蛋白聚糖——多功能蛋白聚糖（Versican, VCAN）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan, ACAN）的积累。基因本体论（Gene Ontology, GO）分析表明，Adamts5?/? OFT中富集了肽酶调节活性和内肽酶抑制活性。丝氨酸肽酶抑制剂F家族成员1（SERPINF1）和前胶原C-内肽酶增强子（PCOLCE）属于差异表达蛋白之列，并通过免疫组织化学和免疫印迹得到验证。这些数据表明，ADAMTS5的缺失放大了OFT发育过程中其他蛋白水解因子的失调。阐明影响蛋白聚糖水平的ADAMTS5网络，可能为AVD找到有效的治疗靶点，因为VCAN和ACAN的大量积累是该病理的标志性特征。
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一、研究背景与意义
主动脉瓣疾病（aortic valve disease, AVD）和升主动脉（ascending aortic artery, AscAo）畸形（主动脉病）是导致发病率和死亡率的重要原因，尤其在老年人群中。约12.4%的75岁以上人群患有主动脉瓣狭窄，约1%的人群具有二叶式主动脉瓣（bicuspid aortic valve, BAV）而非正常的三叶结构，后者是更严重且更早发病的AVD的易感因素，常伴有主动脉病。尽管AVD患病率高且病情严重，但目前尚无药物可延缓疾病进展或促进组织修复，外科手术干预（瓣膜置换和血管移植）仍是标准治疗方案。这些治疗局限性反映了研究人员对瓣膜和血管形成的分子及细胞机制认识不足。
AVD及相关主动脉病的组织病理学研究显示，细胞外基质（extracellular matrix, ECM）扩张且紊乱，大量聚集性蛋白聚糖（尤其是聚集蛋白聚糖ACAN和多功能蛋白聚糖VCAN）积累。在健康的主动脉壁中，ACAN与胶原纤维和平滑肌细胞整合为有序结构，有助于机械韧性；但在病变的主动脉组织中，ACAN沉积显著增加且定位异常。
正常情况下，VCAN和ACAN的水平受ECM蛋白酶（包括ADAMTS家族成员）的严格调控。ECM蛋白酶还受生物力学力（包括胚胎生长中血流的增加）的调控。已有研究证明，缺乏ADAMTS5（一种可切割ACAN和VCAN的ECM蛋白酶）的小鼠会发展出完全外显的半月瓣（semilunar valve, SLV）畸形伴主动脉病。在Adamts5?/?胚胎中，E11.5时异常增大的瓣膜前体组织中VCAN增加明显；E13.5时升主动脉中观察到过量ACAN，恰逢弹性蛋白合成和平滑肌细胞分化的起始。在中期妊娠的Adamts5?/?心脏中，主动脉壁内ACAN和SLV内VCAN持续增加，反映了人类AVD中观察到的病理ECM特征。
为进一步阐明AVD和主动脉病的分子基础，研究人员对心脏流出道（cardiac outflow tracts, OFTs）进行了无偏蛋白质组学分析。OFTs是主动脉瓣和肺动脉瓣（半月瓣）以及升主动脉和肺动脉的发育前体结构。通过对Adamts5?/?小鼠及其野生型同窝小鼠的OFT裂解物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，以鉴定与蛋白聚糖转换相关的新型失调因子，为揭示AVD和主动脉病发病机制中的早期分子事件提供见解。
二、主要技术方法
研究人员从E14.5心脏显微解剖获得心脏流出道（OFT）组织，样本来自4个独立窝别，每个基因型n = 7个生物学重复。采用基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的无标记蛋白质组学分析，在数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）模式下进行肽段鉴定和定量。蛋白质组学数据通过Spectronaut软件搜索小鼠蛋白数据库，使用Perseus进行统计分析，以p值 < 0.05筛选差异表达蛋白。基因本体论（GO）富集分析通过ToppFun?门户和STRING分析完成。验证实验采用免疫组织化学（IHC）、免疫印迹和RNAscope?原位杂交技术，对OFT组织切片和裂解物进行目标蛋白及其mRNA的定位和定量分析。
三、研究结果
3.1 Adamts5+/+与Adamts5?/?心脏OFT的差异蛋白质组分析
对E14.5心脏OFT组织（包含发育中的肺动脉瓣和主动脉瓣、邻近的肺动脉和主动脉以及锚定瓣膜的心肌组织）进行蛋白质组学分析。LC-MS/MS共检测到6331个蛋白质标识符（IDs），其中232个在基因型间表现出统计学显著差异（p值 < 0.05）。在232个蛋白中，39个的log2倍数变化 > 0.5，其中30个上调、9个下调。层次热图显示Adamts5+/+和Adamts5?/? OFT的肽段呈现差异聚类。
3.2 GO术语富集
在232个显著失调蛋白中，最富集的分子功能GO术语包括肽酶调节活性和内肽酶抑制活性，主要由多个丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPINF1、SERPINE2、SERPINF2、SERPINA6、SERPIND1）以及inter-alpha-胰蛋白酶抑制剂重链（ITIH）家族成员（ITIH2、ITIH3、ITIH4）和前胶原C-内肽酶增强子（PCOLCE）的表达增加驱动。此外，参与糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）结合的蛋白（如VCAN、ACAN、HAPLN1、POSTN和PCOLCE）也显著富集。富集的生物学过程包括血液凝固的负调控和止血。STRING分析得到相似的GO术语结果。
3.3 LC-MS/MS验证靶标的选择
差异表达蛋白的读出包括VCAN和ACAN，与既往研究一致。验证靶标的选择标准包括：在Adamts5?/? OFT中具有最显著统计学变化、log2倍数变化大于0.5、且尚未在心血管发育背景下评估过的蛋白。
3.4 蛋白质组靶标SERPINF1的验证
SERPINF1（丝氨酸肽酶抑制剂F家族成员1，又称色素上皮衍生因子PEDF）是一种无活性蛋白酶结构域的丝氨酸蛋白酶。免疫组织化学显示SERPINF1定位于主动脉和肺动脉组织以及半月瓣中。定量分析表明，与Adamts5+/+相比，Adamts5?/?心脏E14.5主动脉壁和外膜中SERPINF1显著增加。RNAscope?显示E14.5时Serpinf1 mRNA在动脉组织外膜和发育中的瓣叶中高表达，并与内皮细胞标志物Pecam1表达重叠。免疫印迹分析验证了Adamts5?/? OFT裂解物中SERPINF1蛋白增加。
3.5 蛋白质组靶标PCOLCE的验证
PCOLCE（前胶原C-内肽酶增强子）在Adamts5?/? OFT裂解物中显著增加。免疫组织化学显示PCOLCE定位于主动脉和肺动脉壁的外膜以及半月瓣中，Adamts5?/?中的蛋白含量高于Adamts5+/+。在Adamts5?/?的肺动脉和主动脉组织中，中膜层的PCOLCE阳性像素多于Adamts5+/+，SLV中PCOLCE阳性像素百分比也更高。RNAscope?显示E14.5时Pcolce mRNA在主动脉外膜细胞和SLV瓣叶中高表达，中膜层平滑肌细胞中较少，内皮细胞中未检测到。免疫印迹验证了三个同窝配对中Adamts5?/?的PCOLCE增加。
3.6 蛋白质组靶标PTX3的验证尝试
PTX3（正五聚蛋白3）是LC-MS/MS分析中上调最显著的差异表达蛋白之一，但免疫组织化学和免疫印迹均未能验证这一发现。免疫印迹检测到45 kD条带（PTX3的预期大小），但未能重现LC-MS/MS观察到的显著差异（每个基因型n = 10）。研究人员评估了五种不同的抗原修复方法、三种固定方案和两种抗体以提高PTX3检测灵敏度，但均未获得基因型间的显著差异。RNAscope?数据显示Ptx3 mRNA在发育中的瓣膜和其他间充质结构中高表达。研究人员推测DIA LC-MS/MS比免疫印迹和IHC更敏感，更好的抗体可能有助于验证Adamts5?/? OFT发育中PTX3表达的增强。
四、讨论与结论
在SLV和AscAo发育过程中，存在大规模的ECM重塑，涉及临时ECM（p-ECM）的去除和特化成熟ECM的组装。p-ECM的去除需要蛋白水解切割VCAN和ACAN以分解高度稳定的聚集性蛋白聚糖。ADAMTS5缺失后，大量蛋白出现失调。由于聚集性蛋白聚糖与生长因子、细胞因子和趋化因子结合，切割不足可能减少这些因子从p-ECM中的释放，从而对发育产生负面影响。蛋白质组学读出中检测到的过量VCAN和ACAN与既往研究一致。成年Adamts5?/?小鼠的主动脉病增加，且表现出ACAN切割产物模式改变和ACAN过量。由于E13.5时即可观察到ACAN水平增加和切割产物改变，ACAN的转换可能是OFT重塑中的重要因素，其破坏可导致成年期主动脉病。这些数据与人类疾病一致，即大量ACAN定位于病变的主动脉组织中。
SERPINF1在含有过量p-ECM的Adamts5?/? OFT中显著上调。尽管SERPINF1属于蛋白酶家族，但它是一种无活性的丝氨酸蛋白酶，仍在ECM中发挥多种作用。在VCAN过量时，其上调可能干扰活性SERPINS对基质蛋白的蛋白水解降解。由于ADAMTS5促进SERPINF1的吞噬作用，Adamts5?/? OFT中SERPINF1的增加可能归因于ADAMTS5介导的SERPINF1吞噬缺乏，从而减少其从p-ECM中的清除。人类SERPINF1基因突变患者表现为严重的成骨不全（osteogenesis imperfecta, OI）6型，归因于胶原组织和基质矿化缺陷。胶原组装改变和异位骨形成也是病变人类主动脉瓣和血管的主要因素。SERPINF1的过表达增强成骨细胞分化和矿化，与AVD一致。
PCOLCE是一种细胞外糖蛋白，结合并促进I型前胶原的酶切切割以成熟为三螺旋胶原纤维。正常情况下，PCOLCE调节I型和III型胶原纤维的产生和组装。由于Adamts5?/?小鼠OFT中胶原组装减少，PCOLCE水平升高可能是ECM含过量VCAN时上调胶原组装的反馈信号。富集分析还表明多个含胶原的ECM蛋白在Adamts5?/? OFT中失调。前胶原I切割位点突变的患者发展为III型OI，OI患者发生心血管异常（包括瓣膜病和主动脉根部增宽）的风险更高。PCOLCE缺陷小鼠表现出胶原纤维形态紊乱和骨力学性能低下。
蛋白质组学分析揭示了ADAMTS5缺失导致的涟漪效应，即大量额外蛋白酶及其调节因子的失调。蛋白质的翻译后切割用于降解或激活，是发育和疾病中快速改变ECM结构的机制。在OFT发育和伤口愈合中，p-ECM均富含VCAN-HA。随着愈合或发育的进展，VCAN被富含胶原的ECM取代以赋予组织强度并减少炎症。Adamts5?/? OFT中改变的蛋白水解级联相关免疫因子的普遍存在表明，发育性ECM转换可能部分利用免疫通路的酶来控制VCAN水平。免疫细胞直接参与瓣膜发育，这些细胞也表达丰富的切割VCAN和ACAN的蛋白酶。
VCAN和ACAN的数量对组织形态有深远影响。在Adamts5?/? OFT中，过量VCAN影响发育中瓣膜的形态，使其与正常瓣膜相比增大且形态模糊。该表型可通过遗传性减少VCAN而得到挽救。相比之下，升主动脉的变形主要在成年Adamts5?/?小鼠中观察到，尽管E13.5时即可见过量ACAN。研究人员预测，发育过程中成熟ECM组装的改变是成年Adamts5?/?小鼠主动脉病的原因。蛋白质组学分析表明SERPINF1和PCOLCE在OFT重塑中发挥作用，可能影响成熟ECM的组成。Pcolce和Serpinf1 mRNA在升主动脉外膜中表达最高，该区域在Adamts5?/?小鼠中表现出与主动脉病相关的异常。
研究结论：ADAMTS5的缺失放大了OFT发育过程中额外蛋白水解因子的失调。蛋白质组学分析揭示了一个由ADAMTS5依赖的蛋白酶网络，该网络在发育过程中影响蛋白聚糖水平。阐明这一网络可能为AVD找到有效的治疗靶点，因为VCAN和ACAN的大量积累是该病理的标志性特征。由于过量VCAN和ACAN导致疾病，阐明在发育中正常减少和转变ACAN和VCAN水平的蛋白酶，可能为治疗成年AVD及相关主动脉病提供新的治疗靶点。再生组织工程也可能受益于解析对SLV和升主动脉发育至关重要的ADAMTS5蛋白酶依赖网络的研究方法。
