《Heliyon》：Co-occurrence of VIM-positive non-aeruginosa Pseudomonas spp. and Pseudomonas aeruginosa in the hospital: A detailed molecular comparison of blaVIM-2-containing plasmids from environmental and clinical isolates
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背景：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起严重医院获得性感染的细菌病原体，能够在医院水槽排水管中形成持续存在的储库，造成传播风险。在本院，研究人员不仅从水槽排水管中培养出产碳青霉烯酶、维罗纳整合子编码金属-β-内酰胺酶（Veron
背景：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起严重医院获得性感染的细菌病原体，能够在医院水槽排水管中形成持续存在的储库，造成传播风险。在本院，研究人员不仅从水槽排水管中培养出产碳青霉烯酶、维罗纳整合子编码金属-β-内酰胺酶（Verona Integron-encoded Metallo-beta-lactamase，VIM）阳性的铜绿假单胞菌，还培养出VIM阳性的非铜绿假单胞菌属（Pseudomonas spp.）。此前，研究人员在本院一株临床铜绿假单胞菌分离株中发现了一个携带blaVIM-2、赋予碳青霉烯耐药性的接合性质粒。
目的：调查本院其他假单胞菌属是否也携带含blaVIM-2的质粒，对这些质粒进行遗传特征分析，并将其与公开可用的质粒序列进行比较，以确定其来源。
方法：研究人员采用全基因组测序（whole-genome sequencing）对VIM阳性非铜绿假单胞菌和VIM阳性铜绿假单胞菌菌株的染色体及可能的质粒进行测序。通过混合组装（hybrid assemblies）重建质粒序列。所有分离株均来自本院一次持续性VIM阳性铜绿假单胞菌暴发期间的环境采样或临床培养。
结果：在6株非铜绿假单胞菌（P. carnis、P. oleovorans及一个新种）和3株铜绿假单胞菌分离株中发现了一个相同的含blaVIM-2质粒。此前报道的含blaVIM-2质粒在另外3株铜绿假单胞菌分离株中被发现。所有铜绿假单胞菌均属于高风险克隆ST111或ST446。这两个质粒均来源于临床分离株和水槽培养物，且与其他公开可用的质粒序列相比，为本院所独有。
结论：在本院VIM阳性铜绿假单胞菌暴发期间，两个密切相关的含blaVIM-2质粒同时出现在多种非铜绿假单胞菌和高风险铜绿假单胞菌克隆ST111及ST446中。从患者或水槽样本中培养出的非铜绿假单胞菌可能是碳青霉烯耐药基因的重要来源，在暴发调查中不应被忽视。此外，质粒分析对于全面了解医院内的传播途径至关重要。
论文解读文章
一、研究背景与目的
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是引起严重医院获得性感染的主要病原体之一，对多种抗菌药物具有固有耐药性。全球范围内碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌菌株的出现，尤其是属于高风险序列型（sequence type，ST）ST111、ST235和ST175的菌株，已引起广泛关注。由这类菌株引起的感染与患者发病率和死亡率的增加密切相关。碳青霉烯耐药在这些菌株中通常由金属-β-内酰胺酶（metallo-beta-lactamase，MBL）的产生所致，而维罗纳整合子编码金属-β-内酰胺酶（Verona Integron-encoded Metallo-beta-lactamase，VIM）是全球铜绿假单胞菌中最常见的MBL，通常以移动耐药基因盒的形式定位于1类整合子上。
在荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心（Erasmus MC），自2003年以来出现了VIM阳性铜绿假单胞菌克隆，引起患者定植和感染。分离株主要属于国际高风险克隆ST446和ST111。此后，环境来源和传播途径受到调查，水槽被确定为本院持续存在的环境储库。尽管blaVIM编码整合子通常位于铜绿假单胞菌染色体上，但Van der Zee等人近期报道了2009年从本院患者中分离的一株ST446克隆铜绿假单胞菌菌株S04 90携带含blaVIM-2的接合性质粒。这一发现令人担忧，因为质粒在同种细菌甚至同属内易于转移。在长达数年的暴发期间，研究人员还从患者环境和患者身上零星分离出多种VIM阳性非铜绿假单胞菌。本研究旨在筛查VIM阳性铜绿假单胞菌和非铜绿假单胞菌分离株中是否存在含blaVIM-2的质粒，对发现的质粒进行遗传特征分析，并将其与其他公开可用的质粒序列进行比较，以确定其来源。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过全基因组测序和混合组装技术，在本院VIM阳性铜绿假单胞菌暴发期间收集的多种假单胞菌分离株中，发现并重建了两个密切相关的含blaVIM-2质粒。一个质粒存在于6株非铜绿假单胞菌（包括P. carnis、P. oleovorans和一个新种）和3株铜绿假单胞菌ST111分离株中；另一个此前已报道的质粒存在于另外3株铜绿假单胞菌分离株中。所有铜绿假单胞菌均属于高风险克隆ST111或ST446。两个质粒均来源于临床分离株和水槽培养物，且经与NCBI公共数据库中的质粒序列比较，被证实为本院所独有。研究表明，非铜绿假单胞菌可能是碳青霉烯耐药基因的重要储库，在医院暴发调查中不应被忽视，质粒分析对于理解医院内耐药基因的传播途径至关重要。
三、关键技术与方法
研究人员采用了以下主要技术方法：全基因组测序（whole-genome sequencing）用于对VIM阳性非铜绿假单胞菌和VIM阳性铜绿假单胞菌菌株的染色体及可能质粒进行测序；混合组装（hybrid assemblies）策略结合Illumina短读长和Oxford Nanopore Technologies（ONT）MinION长读长数据，在Unicycler软件中重建质粒序列；重测序（resequencing）方法通过将Illumina读段以98%的高严格度比对至质粒序列，用于鉴定携带相同质粒的菌株；菌种鉴定采用Type Strain Genome Server（TYGS）平台分析基因组组装结果；铜绿假单胞菌多位点序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）通过BioNumerics软件同步至PubMLST.org数据库完成；核心基因组多位点序列分型（core-genome multilocus sequence typing，cgMLST）使用SeqSphere+软件中的铜绿假单胞菌方案；质粒序列分析采用MOB-Typer软件包；全基因组比对在CLC Genomics Workbench中进行；插入序列（insertion sequence，IS）鉴定使用ISfinder软件。样本来源包括本院ICU-2、外科病房和泌尿科病房的水槽环境采样（洗手盆、台面、水龙头起泡器和水槽排水管）以及临床培养标本。
四、研究结果
4.1 铜绿假单胞菌S04 90质粒序列的重建
研究人员对原始铜绿假单胞菌菌株S04 90（本院保存名为VIM-PA R-340）进行了重新测序，并通过混合组装重建了质粒。结果确认了质粒序列的存在和同一性，仅有微小差异：在159,166个核苷酸中有7个核苷酸与已发表序列不同（99.996%同一性），其中4个位于blaVIM-2编码整合子的序列中。与已发表序列相比，VIM-PA R-340在基因盒阵列中编码aac(6′)29a和aac(6′)29b基因，分别位于blaVIM-2基因的两侧。此外，已发表序列末端的21个核苷酸与起始21个核苷酸完全重复，而在重建中仅发现一个拷贝。
4.2 非铜绿假单胞菌分离株及质粒序列分析
6株VIM阳性非铜绿假单胞菌分离株含有完全相同的质粒序列：1株P. oleovorans、2株P. carnis和3株新种假单胞菌。两株P. carnis最初被MALDI-TOF质谱（MS）鉴定为P. alcaligenes和P. gessardii，测序后被重新分类为P. carnis。3株新种假单胞菌最初被MALDI-TOF MS鉴定为P. putida。所有6株非铜绿假单胞菌的质粒序列均含有blaVIM-2基因。其中5株来自同一病区ICU-2不同患者房间的水槽环境（洗手盆或排水管），分离时间为2013年至2016年；第6株（新种假单胞菌）于2014年从ICU-2的一名患者中分离。
对铜绿假单胞菌VIM-PA R-340和P. carnis VIM-PC R-7810（命名为pR7810）的质粒序列比对显示高度相似性，仅有微小差异。最明显的差异是一个4.7-kbp编码假设蛋白的区域发生重排；此外，在VIM-PA R-340的质粒序列中发现了一个与ISpst3（IS21家族）99%相同的2.6-kbp插入序列，该插入序列仅在VIM-PC R-7810的染色体中存在；在pR7810的对应区域中，取而代之的是一个含有复制性DNA解旋酶和乙二醛酶编码基因的3.3-kbp区域。最后，一个与IS222（IS3家族）98%相同的1.2-kbp插入序列仅存在于VIM-PA R-340的质粒序列中。除这些差异外，两个质粒序列完全相同，包括1类blaVIM-2编码整合子的序列。该整合子序列与荷兰大多数VIM-2阳性铜绿假单胞菌分离株携带的Type A整合子相同，且整合子嵌入在一个大的DNA片段上的复合转座子结构中。MOB-Typer分析显示两个质粒均为MPF I型接合质粒，rep簇339，含MOB松弛酶Q型。
通过BLAST搜索，研究人员检索到13个与VIM-PA R-340质粒序列覆盖率超过50%的质粒序列并进行全基因组比对，所有序列共享高度相似的骨架结构。然而，基于k-mer的聚类分析显示这些质粒仍然相当多样。本研究的两个质粒与已发表的铜绿假单胞菌S04 90质粒序列紧密聚集，但与NCBI中其他质粒序列明显不同，表明这两个质粒为本院所独有。
4.3 铜绿假单胞菌分离株及质粒序列分析
3株VIM阳性铜绿假单胞菌分离株（VIM-PA 43337、VIM-PA 5009和VIM-PA R-14745）含有与铜绿假单胞菌VIM-PA R-340完全相同的质粒序列。这些菌株于2016年至2017年间从ICU-2同一患者房间的水槽排水管样本中分离。另有3株VIM阳性铜绿假单胞菌（VIM-PA R-15694、VIM-PA R-16609和VIM-PA R-16738）含有与P. carnis VIM-PC R-7810的pR7810完全相同的质粒序列。VIM-PA R-15694于2017年从一名患者中分离，该患者曾入住2013年分离出P. carnis VIM-PC R-7810的ICU-2患者房间，采样时已转至外科病房；2018年，另外两株铜绿假单胞菌从同一外科病房患者房间的水槽排水管样本中分离。所有6株VIM阳性铜绿假单胞菌均被鉴定为ST111高风险克隆，cgMLST分析显示它们密切相关。铜绿假单胞菌VIM-PA R-340被确认为高风险克隆ST446。此外，所有菌株的blaVIM-2基因仅存在于质粒序列中，而非染色体上。
五、讨论与结论
本研究加强了越来越多的文献支持的观点，即非铜绿假单胞菌可能作为blaVIM-2基因的储库，医院环境可能参与此类基因的传播循环。研究人员在本院发现了一个由6株非铜绿假单胞菌（P. oleovorans、P. carnis和新种假单胞菌）和3株铜绿假单胞菌ST111分离株携带的含blaVIM-2质粒，该质粒与先前在本院发现的铜绿假单胞菌S04 90（ST446克隆）中的质粒高度相似。另外3株铜绿假单胞菌ST111分离株携带与此前报道质粒完全相同的质粒。所有铜绿假单胞菌ST111分离株密切相关。非铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌分离株均来自临床和水槽培养物。本研究的两个质粒与其他公开质粒序列在遗传上存在明显差异，来源尚不明确。值得注意的是，这两个质粒密切相关，并在长达九年的研究期间保持稳定。研究人员推测这两个含blaVIM-2质粒很可能在伊拉斯姆斯医学中心内，以水槽排水管作为主要环境储库，在高风险铜绿假单胞菌克隆和其他假单胞菌属之间转移。据研究人员所知，这也是首次报道VIM-2阳性的P. carnis，以及第二次报道含blaVIM-2编码质粒的P. oleovorans。
铜绿假单胞菌经常从医院环境的潮湿场所（如水槽排水管和淋浴间）中被分离，可形成持续存在的储库，通过飞沫将活菌传播至患者周围环境。其他假单胞菌属，如P. putida组的成员，也可能存在于这些场所。尽管非铜绿假单胞菌很少成为人类感染的来源，因此在临床环境中常不被研究或监测，但已有大量报道确定非铜绿假单胞菌是MBL基因的携带者。本研究独特之处在于水槽排水管在含blaVIM-2质粒分离株长期持续存在中的重要作用，这可能与患者-环境和环境-患者传播均有关联。研究结果强调，在暴发调查中不应忽视非铜绿假单胞菌，而应将其纳入碳青霉烯酶的筛查范围。
P. carnis是一种新描述的环境物种，与肉类和豆制品的食品腐败有关，但此前从未被报道引起人类感染或携带blaVIM。P. oleovorans被认为是一种环境分离株，仅在极少数情况下引起免疫功能低下个体的感染。在阿根廷，研究人员在一株P. oleovorans临床分离株携带的质粒上发现了位于1类整合子上的VIM-2，该整合子从阿根廷不同医院分离的其他非铜绿假单胞菌的不同大小质粒中被回收。P. putida也很少成为人类机会性感染的来源，但仍是报道最多的携带多药耐药基因（包括blaVIM）的非铜绿假单胞菌。然而，本研究也表明，被鉴定为P. putida的分离株可能并非真正的P. putida，而可能属于其他物种，包括新种；MALDI-TOF MS的局限性意味着需要测序才能进行这种区分。
通过BLAST搜索和比对匹配的质粒序列，研究人员在NCBI中鉴定了13个与本研究质粒骨架结构相似的序列，但k-mer分析显示本研究质粒在遗传上仍与其他序列不同，因此两个质粒的来源无法确定。最邻近的序列（登录号CP034355.1）来自一株比利时分离的铜绿假单胞菌，其染色体携带碳青霉烯酶基因blaIMP-13，质粒上未编码blaVIM-2或其他碳青霉烯酶。这些差异表明本研究中的质粒为本院所独有，从更广泛的背景来看，是荷兰独有的两个假单胞菌质粒。此外，虽然blaVIM通常编码在铜绿假单胞菌染色体上，但本研究中所有分离株的blaVIM仅位于质粒上。Van der Zee等人推测blaVIM-2编码整合子所嵌入的复合转座子可以在质粒和染色体之间移动，这很可能发生在本院内。研究人员推测，在某个时间点，blaVIM-2编码整合子转移到质粒上，随后在伊拉斯姆斯医学中心内的假单胞菌属之间多样化，最可能是在水槽排水管的湿性生物膜中。
本研究的一个优势是对多株VIM阳性非铜绿假单胞菌进行了测序以筛查blaVIM-2编码质粒。此外，自2011年以来伊拉斯姆斯医学中心进行了广泛的环境采样，菌株被长期保存，这有助于追踪含blaVIM-2质粒多年来的移动和进化。但研究也存在局限性：并非所有VIM阳性铜绿假单胞菌菌株都被测序，菌株是根据分离年份和来源地点选择的；环境采样并非医院常规进行，采样决定受患者意外检出多重耐药微生物或疑似传播的指导，或用于监测旨在限制VIM阳性铜绿假单胞菌水槽排水管储库传播的干预措施效果，因此可能遗漏了其他携带含blaVIM-2质粒的假单胞菌菌株；最后，未使用两个已鉴定的质粒进行接合实验来验证其可转移性，但Van der Zee等人的文章已证明铜绿假单胞菌S04 90的质粒具有接合性，本研究质粒与该已发表质粒高度相似，很可能也具有接合性，且多个假单胞菌属中存在相同序列强烈提示质粒转移的发生。
研究结论：研究结果揭示了两个密切相关的含blaVIM-2质粒在多种非铜绿假单胞菌和高风险铜绿假单胞菌克隆中的共存，这些克隆来源于患者房间水槽和临床培养物。这为医院内最可能发生了环境-患者或患者-环境传播提供了证据，非铜绿假单胞菌在质粒的传播循环中发挥了作用，尽管质粒的起源仍不清楚。为有效进行感染预防和控制，应将非铜绿假单胞菌视为blaVIM或其他碳青霉烯酶基因的潜在储库。此外，为全面了解医院内耐药基因的传播途径，质粒分析至关重要。
