儿童骨骼系统感染（PSSIs）的实验室诊断：从病原培养到分子检测及宏基因组二代测序（mNGS）的能力与边界

《Journal of Clinical Microbiology》：Diagnosing pediatric skeletal system infections: you are as good as your lab

　　

儿童骨骼系统感染（pediatric skeletal system infections, PSSIs）是医疗急症，可能导致严重急性并发症和长期骨科残疾。由于脓毒性关节炎（septic arthritis）和骨髓炎（osteomyelitis）的临床表现可能模仿非感染性疾病，早期识别致病病原体并确定其抗生素敏感性谱（antibiotic susceptibility profile）是患者管理的基石。儿童骨骼系统感染的病因随时间发生变化，反映了针对b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的结合疫苗（conjugate vaccines）的实施，以及敏感分子检测方法的发展。这些新型实验室方法，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技术对病原体的快速鉴定，降低了“培养阴性”（culture-negative）感染的比例，并将病原体鉴定的周转时间从数天缩短至数小时。然而，即使在今天，相当一部分骨与关节感染仍在微生物学上未获确认。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）具有很大前景，但其高成本、对技术专长的需求，以及检测意义可疑的共生微生物，严重限制其常规应用。另一方面，mNGS并未扩展已知儿童骨骼系统病原体清单，提示当前诊断方法利用不足而非灵敏度降低，是诊断欠佳的原因。

引言（INTRODUCTION）：文章指出，儿童骨骼系统感染（PSSIs）包括脓毒性关节炎、骨髓炎和椎间盘炎，若未早期诊断和适当治疗，可转为慢性、引起脓毒症甚至死亡，并因对发育中骨与关节造成不可逆损伤而导致永久性功能障碍。PSSIs在幼儿期更常见。鉴定病原体并测定其抗生素敏感性是管理的核心，有助于靶向治疗并避免在耐药背景下过度使用广谱抗菌药物。文章从历史视角讨论PSSIs流行病学变化及当前微生物学方法在免疫功能正常儿童中的能力与局限。

PSSIs：一个难以明确的诊断（PSSIs: AN ELUSIVE DIAGNOSIS）：典型发热、局部疼痛和炎症并伴急性期反应物升高应怀疑PSSIs，但暂时性非细菌性滑膜炎、风湿性疾病、创伤或恶性肿瘤等可模仿骨与关节感染，因此实验室病原学检测对确诊和规范治疗至关重要。分离细菌可进行抗生素敏感性试验（antibiotic susceptibility testing），帮助个体化治疗并为疗效不佳或不耐受者寻找替代方案。对病情严重或快速进展者，应在留取血培养后尽快经验性抗菌治疗；一般状况良好者可延迟抗生素直至采集骨组织或关节液等源标本进行培养。历史上，培养敏感性低、周转时间长（2–4天）及药敏结果延迟限制了管理；病原未明时常用广谱抗生素或联合治疗覆盖常见菌，尤其是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），但该策略对Kingella kingae不适用，因其对异噁唑基青霉素、糖肽类、利奈唑胺和克林霉素等抗葡萄球菌药物天然耐药；布鲁菌（Brucella）感染也需四环素类或利福平等特定联合治疗。

PSSIs不断变化的病因（THE EVER-CHANGING ETIOLOGY OF PSSIs）：绝大多数PSSIs由正常人体微生物群成员，尤其上呼吸道菌群，突破上皮屏障后经血流播散至骨骼组织所致；邻近病灶扩散、穿透伤、咬伤或手术仅占少数， zoonotic细菌或环境腐生菌所致者较少。文章按年龄和危险因素归纳了血源性PSSIs的细菌病因，涉及呼吸道、胃肠道、生殖道和皮肤等自然栖息地，并强调不同年龄段的优势病原体及风险因素。

结合细菌疫苗对PSSIs病因的影响（THE IMPACT OF CONJUGATE BACTERIAL VACCINES ON THE PSSIs ETIOLOGY）：自1987年有效b型流感嗜血杆菌结合疫苗实施后，疫苗覆盖良好国家中该菌侵袭性感染日益少见；传统上毒力较低的非b型荚膜型和非分型流感嗜血杆菌主要见于免疫受损儿童，但近年来a和f血清型等在健康儿童中的发病率在许多国家上升。肺炎链球菌在1991年前占6岁以下儿童培养阳性关节炎的6.6%，引入肺炎球菌结合疫苗后也成为少见病因；2000–2015年美国八家儿童医院调查中，肺炎球菌仅占PSSIs的3.3%，主要见于婴幼儿和幼儿，PCV13覆盖血清型所致病例减少87%。

血培养与滑液及骨组织培养的比较（BLOOD CULTURES VS SYNOVIAL FLUID AND BONE TISSUE CULTURES）：尽管分子方法应用增加，分离病原体仍可提供药敏信息。多项研究中源标本培养始终优于血培养。根据IDSA指南，脓毒性关节炎血培养平均阳性率为20.0%（95% CI：13.7%–26.2%），滑液培养为40.1%（95% CI：33.5%–46.7%）；骨髓炎血培养平均31.2%（95% CI：26.3%–36.0%），骨培养65.4%（95% CI：55.5%–75.3%）。文章汇总相关研究比较各菌种血培养与源培养阳性比例，提示滑液和骨培养在多种病原体上敏感性更高，尤其对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌（S. pyogenes）、Kingella kingae和肠杆菌目（Enterobacterales），说明PSSIs菌血症期多较短，细菌更易从血流而非感染骨与关节中清除。

将骨与关节标本接种至血培养瓶以提高细菌分离率（IMPROVING BACTERIAL ISOLATION BY SEEDING BONE AND JOINT SAMPLES INTO BLOOD CULTURE VIALS）：传统固体培养基之外，将滑液抽吸液和骨渗出物接种至血培养瓶（blood culture vials, BCVs）可提高分离率。前瞻性评价显示BACTEC Peds Plus/F BCVs较固体培养基检出更多病原体且污染更少；Moumile等研究中37份培养阳性骨关节标本中14份（37.8%）仅BCVs阳性，无固体培养基阳性而BCVs阴性者。PSSIs常菌量低，样本体积关键：培养皿容纳<0.5 mL，而儿科BCV可接种多至5 mL；滑液具抑菌特性，注入大体积营养肉汤可稀释补体、抗体和抗生素等不利因素；BCVs中皂苷等裂解剂可释放已吞噬但仍存活的微生物，含抗生素结合树脂者有利于已接受抗菌治疗者检测。1988年研究人员偶然发现滑液接种BCVs可分离Kingella kingae，而固体培养常失败；阳性肉汤转种血琼脂和巧克力琼脂后该菌易于回收。K. kingae PSSIs患者显著更年轻，>95%为6–48月龄，是学龄前儿童关节、骨和椎间盘感染最常见病因；多数累及四肢大骨与大关节，也可侵犯脊柱、手足小关节及骶髂和胸锁关节。患儿一般状况好、发热轻或无热、炎症标志物低，易被低估；滑液革兰染色很少阳性，推测因菌量低（11–300 CFU/mL，中位15 CFU/mL）；>20%患者关节液白细胞<50×10⁹/L，低于疑似脓毒性关节炎 cutoff；Kocher和Caird标准常不能识别K. kingae骨关节炎。

肠杆菌目、非发酵菌及其他少见PSSI病原体（ENTEROBACTERALES, NON-FERMENTATIVE BACTERIA, AND OTHER UNCOMMON PSSI PATHOGENS）：沙门菌（Salmonella enterica）常见于镰状细胞病和其他血红蛋白病患者的骨感染；发展中国家大肠埃希菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌和柠檬酸杆菌属等肠杆菌目也是常见病因，工业化国家这些革兰阴性菌几乎仅影响新生儿和3月龄以下儿童。假单胞菌属（Pseudomonas spp.）可致免疫受损者血源性PSSIs及甲刺伤后足底感染。脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）脓毒性关节炎占侵袭性脑膜炎球菌病1.5%，多见于5岁以下、青少年及补体和备解素缺陷者，滑液分离不理想，16S rRNA基因扩增测序可提高检出。淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）见于性活跃青少年，青春期前儿童分离出该菌是儿童虐待的确凿证据。伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）在蜱暴露和游走性红斑者建议临床诊断，非典型表现优先抗体检测而非培养或NAATs，初阴者2–3周后恢复期血清复查。 Burkholderia pseudomallei培养可长达7天且敏感性低，采用16S rRNA PCR和种特异性NAATs。布鲁菌属现代自动血培养系统可在常规5–7天培养期内从血和滑液分离，APHL指南建议10天保留并盲传；血清学标准凝集试验（SAT）≥1:160可作推定诊断，ELISA IgG支持但需SAT确认，急性期与恢复期抗体4倍升高可确诊。 Streptobacillus moniliformis致北美鼠咬热，苛养但可用自动血培养系统分离，生化、MALDI-TOF MS和16S rRNA测序可鉴定。 Spirillum minus致亚洲鼠咬热，不能合成培养基分离，需动物接种，无基因组信息，仅暗视野或Wright/Giemsa染色见典型卷曲杆状。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）骨关节受累占结核患者2%，传统涂片和固体培养慢且敏感低；MGIT液体培养周转约21天，固体培养2–6周且药敏另需5–7天至数周；GeneXpert MTB/RIF和Innowave MTB/RIF/INH等NAATs数小时诊断并同时检测利福平和异烟肼耐药，但用于滑液和骨组织属超说明书且需独立验证。其他少见病原体已有综述。

PSSIs的当前病因（CURRENT ETIOLOGY OF PSSIs）：不同报道中病原体患病率差异大，与纳入标准、发达与发展中地区、年龄范围和检测方法（尤其培养与分子方法）有关。工业化国家社会经济改善、疫苗接种和敏感分子技术常规使用显著降低PSSIs发生率并改变病原谱。法国2009–2013代表性研究中，金黄色葡萄球菌占骨与关节感染41%，其次K. kingae 29%、S. pyogenes 15%、无乳链球菌和肺炎链球菌各3%，其他菌种10%。发展中国家儿童骨与关节感染常见，金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌目、S. pyogenes和肺炎球菌仍流行。

采用MALDI-TOF MS技术鉴定PSSI病原体（IDENTIFICATION OF THE PSSI AGENTS BY MALDI-TOF MS TECHNOLOGY）：传统临床微生物实验室鉴定依赖最适生长温度、菌落形态、厌氧或二氧化碳需求、革兰染色、镜检和生化谱，复杂且耗时。MALDI-TOF MS将鉴定从数天缩短至加样和鉴定<3分钟。两种商用系统总体性能相当，Bruker Biotyper对革兰阳性菌种水平鉴定较好，Vitek MS对厌氧菌和α-溶血性草绿色链球菌鉴定更优。设备资本投入大但试剂便宜，可节省试剂、技师时间和维护成本，数年可抵消初始成本，并可能通过早期鉴定改善管理、缩短住院和降低治疗费用。

核酸扩增检测在PSSIs诊断中的应用（NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS IN THE DIAGNOSIS OF PSSIs）：NAATs提供数小时内的准确快速结果，尤其适用于不可培养和苛养微生物，是检测难培养K. kingae和慢生长M. tuberculosis的首选。NAATs可检测活菌和非活菌，较培养更少受既往抗生素影响，使已接受抗生素者仍可诊断，并可能减少医生在采样前启动抗菌治疗的顾虑。广谱PCR测序（Use of broad-range PCR sequencing for the diagnosis of PSSIs）：早期采用16S rRNA基因常规PCR扩增、扩增子测序并与 curated数据库比对实现精确鉴定，可早期诊断并降阶梯广谱抗生素；但 labor-intensive、耗时、易污染，用于血标本不优于传统血培养，且非靶向检测可检出定植或污染菌。K. kingae因难分离成为分子诊断自然候选，通用16S rRNA基因扩增对K. kingae检测阈值300 CFUs/mL，对滑液中低浓度处临界敏感；尽管如此，该方法较BCV培养提高K. kingae诊断4倍，确认其为6–48月龄儿童PSSIs最常见病原。西班牙研究显示，2002–2008未用分子技术时35例中11例（31.4%）培养阳性且未分离K. kingae；2009–2023采用16S rRNA PCR后46例中29例（63.0%）诊断，K. kingae检出14例（48.3%）。广谱PCR测序还可提高肺炎球菌、S. pyogenes、Moraxella nonliquefaciens和肠革兰阴性菌等传统病原体检出，减少培养阴性PSSIs；但常规培养易分离金黄色葡萄球菌，NAATs额外收益有限。种特异性PCR（Species-specific PCR assays for diagnosing PSSIs）：实时PCR靶向种特异性基因已取代原始16S rRNA技术，更敏感、省力、抗污染并可同时分析多份样本；许多可同时检测病原体和临床相关耐药特征，如Cepheid MRSA/SA SSTI PCR从脓毒性关节炎或骨髓炎患者鉴定金黄色葡萄球菌并同时检测甲氧西林和克林霉素耐药。K. kingae无FDA清除的独立商用分子检测，需送参考实验室，结果可能2–7天，抵消分子诊断优势；实验室自建NAATs靶点包括通用16S rRNA、种特异性rtx操纵子、cpn60、mdh及GenBank KC142163.1等，但自建对许多临床微生物实验室成本过高。多重分子检测（Multiplex molecular tests）：单种检测的缺点是不能覆盖症状重叠的众多PSSIs病原，syndromic PCR用多引物靶向最可能病原，简化开单和实验室流程，节省时间、资源和样本；但多重NAATs因引物竞争共享酶和dNTPs，扩增效率可能低于单靶标PCR，且所有靶标需同一扩增条件，可能降低个别微生物检测敏感性。商用BIOFIRE JI panel靶向31种包括K. kingae和白色念珠菌及8个耐药基因，针对成人假体周围骨关节感染，组织活检较滑液敏感但需验证；儿童相关靶标仅少数，与实验室自建六种儿科病原panel比较，商用多重法在16份滑液中漏检1份；Copley等中培养和/或16S rRNA PCR加Sanger测序在65份关节液中29份（44.6%）检出panel内细菌，BIOFIRE JI亦检出相同菌，并检出通用PCR阳性而培养阴性菌。LAMP技术（LAMP technology in the diagnosis of PSSIs）：等温核酸扩增无需热循环仪，LAMP是PSSIs诊断有前景策略。Chen等开发微流控LAMP，用万古霉素包被磁珠捕获金黄色葡萄球菌，外磁场收集，裂解后LAMP，ethidium monoazide可视化；将标准金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌加标滑液，分析灵敏度10³–10⁶ CFU/mL，比PCR低一个数量级；20份疑似假体周围关节感染滑液中14份否定感染者为阴性，其余6份检出目标革兰阳性菌。口咽NAAT诊断K. kingae PSSIs（Diagnosing K. kingae PSSIs by oropharyngeal NAAT testing）：K. kingae常侵犯椎间盘和小或难及关节骨，源标本常不可得，尤其椎间盘炎和骶髂关节炎诊断困难；幼儿采样需镇静和影像引导，椎间盘活检有风险，实验研究提示针穿损伤可致椎间盘退变；以色列124例椎间盘炎仅2例脊柱活检且未分离病原。因口咽K. kingae定植是血源播散和组织侵袭必要条件，采用口咽标本敏感K. kingae特异性NAAT作为无创替代；临床相符儿童阳性提示病因，阴性预测值高，未检出DNA可能排除。但IDSA未推荐口咽PCR诊断K. kingae PSSIs；6–48月龄相关人群背景携带率约10%，日托儿童加倍，降低阳性预测值。丹麦研究中16例确诊K. kingae骨关节感染儿童口咽DNA均阳性，但112例排除K. kingae PSSIs对照中33例（29.5%）阳性，特异性71%（95% CI：61%–79%），阳性预测值33%（95% CI：20–48%）；葡萄牙多中心39例确诊中36例（92.3%）口咽NAAT阳性，57例对照中20例（35.1%）阳性，提示大量无症状定植。第二个 caveat 是rtx操纵子NAAT也检测产RTX的Kingella negevensis，该新种临床意义未明且儿童口咽携带，降低特异性。

宏基因组二代测序用于PSSIs诊断（METAGENOMIC NEXT-GENERATION SEQUENCING FOR THE PSSIs DIAGNOSIS）：尽管NAATs能力强，相当部分PSSIs仍细菌学未确认，需新实验室方法。mNGS逐渐用于感染病诊断，包括骨骼系统感染。样本（常为血、脑脊液和滑液）离心分离游离DNA，建库测序，去除人源reads，剩余序列推定属病原并定量，与 curated数据库比对鉴定，无需预先假设病原；理论上可检测任何病原，可鉴定>1400种，周转<48小时。Ramchandar开创性研究评估42例疑似关节骨感染儿童手术源样本，mNGS在26例（61.9%）检出病原，培养19例（45.2%）；但纳入NAAT结果后，PCR加培养联合诊断率与mNGS相似（24例[57.1%] vs 26例[61.9%]），提示mNGS较传统方法未显著影响临床管理。血浆微生物游离DNA（microbial cell-free DNA, mcfDNA）检测即“液体活检”，不仅检测血流中微生物，也检测局灶感染微生物，病原DNA从感染部位漏入血，故可快速微创诊断深部感染，避免侵入性手术取源标本；无假设mNGS策略尤其适合免疫受损者多种机会性微生物及标准实验室失败者。多中心研究中商用mcfDNA Karius检测在10例<24月龄椎间盘炎儿童检出K. kingae，血培养均阴性，组织NAAT仅1例检出；阳性mcfDNA使9例缩窄抗菌治疗，8例免活检（1例在Karius结果前已活检）。但该技术不足：每检测$1,000–2,500，可能替代信息较少诊断方式并减少住院费用；操作繁琐 labor-intensive，现有样本制备试剂盒对片段化降解DNA如mcfDNA效率低；需昂贵设备、广泛数据库和分子生物学与生物信息学专长，多数临床微生物实验室不具备。因极敏感，mNGS检出更多微生物，但可假阳性，每样本中位6个可报告分类群；推定病原浓度通常高于污染种但并非总是如此；假读数常代表人体表面定植细菌和真菌DNA、肿瘤和移植患者屏障破坏定植菌、手术介入引入菌，还包括潜伏疱疹病毒和呼吸道病毒、环境背景微生物和试剂污染物。反之，传统方法检出菌可被mNGS漏检；一项研究比较Karius与培养，34例中23例（67.6%）培养阳性（7例血培养、8例手术培养、8例两者），38例入组中31例有mcfDNA结果，25例（80.6%）阳性；11例（44.0%）检出单一菌，14例检出多种菌，多见于侵入性操作后采血。一例儿童骨关节炎仅培养大肠埃希菌，Karius检出20种细菌和1种霉菌DNA却未检出大肠埃希菌；6例培养阴性者mcfDNA阳性均检出流感嗜血杆菌，在普遍Hib结合疫苗时代意外；因mNGS不区分Hib、其他荚膜型和无荚膜株，可能检出上呼吸道定植无荚膜菌泄漏DNA。因此检出多种潜在病原需诊断 stewardship 和结合临床流行病学谨慎解释。新型Helion-4 Chemistry（H4C）基质内样本到DNA测序平台简化Karius流程；因无需DNA提取，较其他建库快，手工2.25小时、总流程约6小时且不受批次大小影响，适合繁忙临床微生物实验室和紧急应用；平台分析敏感性提高，回收内源mcfDNA增58–817倍并减少外源背景。总之mNGS有前景，可鉴定培养或NAAT不能检出的传统和苛养微生物，避免侵入性诊断、缩短住院和降低成本；但许多技术问题尚存，尚未充分发挥潜力。值得注意的是，尽管mNGS理论上可检测任何微生物，其应用并未发现传统培养和NAATs遗漏的新PSSI病原，提示儿童骨与关节感染病原清单可能限于目前已知者；未能鉴定病原更可能反映现有检测方法利用不足或存在未被识别的模拟PSSIs的非感染性疾病。

新技术是否使传统方法过时（DO THE NOVEL TECHNOLOGIES RENDER THE TRADITIONAL METHODS OBSOLETE?）：尽管分子和MALDI-TOF MS技术在临床微生物实验室作用增加，许多传统 bench tests 仍是重要工具，为细菌鉴定和药敏提供快速、实用、成本效益方案，如显色硝基头孢菌素纸片检测金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、K. kingae、脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的β-内酰胺酶；Clearview PBP2a SA Culture Colony Test检测MRSA；D试验检测革兰阳性菌诱导型克林霉素耐药；乳胶凝集试验确认无乳链球菌。

结论（CONCLUSIONS）：PSSIs临床表现可模仿非感染性疾病，早期病原鉴定可确认怀疑并排除替代诊断。免疫功能正常儿童血源性PSSI病原谱相对有限，但病原体毒力、生物学行为和药敏不同。培养检测方法进步和NAATs使用显著改善PSSIs实验室诊断，确认K. kingae为幼儿关节骨感染主要病因，并减少培养阴性比例。然而即使敏感分子检测，相当部分疑似PSSIs仍细菌学未确认。无偏mNGS可检测任何病原，越来越多用于感染病包括难明骨关节感染；但高成本、需广泛技术专长和检出共生菌等不足严重。出乎意料的是，mNGS未发现培养和NAATs未识别的新PSSI病原，提示病原清单可能限于目前已知；培养阴性脓毒性关节炎和骨髓炎更可能源于现有诊断方法利用不足或非感染性疾病，而非实验室工具敏感性欠佳。