全基因组测序揭示2018–2021年明尼苏达州临床空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的毒力与抗菌药物耐药决定因素及基因型-表型一致性

《Journal of Clinical Microbiology》：Whole genome-based characterization of virulence and antimicrobial resistance determinants in clinical Campylobacter jejuni isolates from Minnesota, 2018–2021

　　

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球食源性胃肠炎的主要病因，并因对氟喹诺酮类（fluoroquinolones）和大环内酯类（macrolides）耐药性增加而被美国疾病控制与预防中心列为严重公共卫生威胁。本研究采用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）对2018年至2021年自明尼苏达州居民采集的2,783株临床空肠弯曲菌分离株（98.4%粪便、1.2%来源不明、0.4%血液及1株直肠拭子）进行毒力和抗菌药物耐药（antimicrobial resistance, AMR）谱特征分析。超过90%的分离株携带与应激防御（stress defense）（rpoN和htrB）、细胞致死膨胀毒素（cytolethal distending toxin, CDT）（cdtA、cdtB和cdtC）以及细胞黏附与侵袭（cell adhesion and invasion）（ciaB、cadF和flaC）相关的基因。检测到多种抗菌药物耐药基因，其中β-内酰胺（beta-lactam）耐药基因的流行率尤其高。29%的分离株存在5种与喹诺酮耐药（quinolone resistance）相关的gyrA点突变，其中T861替换最为常见。在表型上，四环素耐药（tetracycline resistance）最常见（52.3%），其次为喹诺酮耐药（30.7%），而对其他抗菌药物类别——大环内酯类（macrolide）（2.4%）和氨基糖苷类（aminoglycoside）（1.8%）——的耐药不常见。为评估基因型与表型抗菌药物耐药谱之间的相关性，研究人员将一部分分离株的抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility testing, AST）结果与基因型耐药谱进行比较。结果显示总体相关性较强，尤其是对四环素和喹诺酮类，但也检测到24处不一致。在大多数不一致（n = 21）中，表型耐药的分离株缺乏基因组抗菌药物耐药标志物，提示可能存在未知耐药机制或当前测序分析方法的局限性。其余3处不一致发生在携带tet(O)耐药基因但表型对四环素敏感的分离株中。这些发现强调了全基因组测序在改进抗菌药物耐药监测和理解空肠弯曲菌毒力相关因素方面的价值，支持将其整合到常规监测实践中，以更好地管理和理解食源性病原体（foodborne pathogens）的抗菌药物耐药。

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球细菌性胃肠炎的主要病因之一，在健康个体中常呈自限性，但儿童、老年人和免疫功能低下者等高风险人群可发生严重感染，必要时需使用大环内酯类（macrolides）或氟喹诺酮类（fluoroquinolones）治疗。全球范围内空肠弯曲菌耐药性上升带来公共卫生风险；美国国家抗菌药物耐药监测系统（National Antimicrobial Resistance Monitoring System, NARMS）2019年综合报告显示，人源分离株中氟喹诺酮耐药比例由2018年的29%升至2019年的34%，鸡肉零售样本和盲肠内容物中亦见类似上升。空肠弯曲菌自然宿主广泛，包括野鸟、牛、羊和家禽，未煮熟或生禽肉被认为是散发性弯曲菌病的主要来源，未巴氏消毒奶或污染水常与暴发相关。公共卫生实验室以往采用脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）进行亚型分析，2019年PulseNet国家实验室网络转向全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）用于食源性疾病暴发检测和调查，WGS可提供高分辨率遗传信息，用于系统发育分析及毒力和抗菌药物耐药（antimicrobial resistance, AMR）分子标志物筛查。明尼苏达州卫生部公共卫生实验室（Minnesota Department of Health, Public Health Laboratory, MDH-PHL）自2018年起对所有可获得的弯曲菌分离株开展常规WGS，但尚未进行广泛基因组特征分析。因此，研究人员利用WGS描述临床空肠弯曲菌分离株的基因型AMR和毒力相关因子谱，并将部分临床分离株的表型耐药数据与基因型AMR谱比较，以评估WGS预测空肠弯曲菌表型抗菌药物耐药的准确性，为区域监测提供基线。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员纳入2018–2021年明尼苏达州居民临床空肠弯曲菌分离株3,628株，经N50、基因组总长度、BUSCO完整性和平均覆盖度质控后，2,783株进入分析；其中547株按NARMS监测每20株随机选取用于抗菌药物敏感性试验（AST）。WGS采用Illumina MiSeq 250-bp双端测序，Trimmomatic质控、Skesa组装，QUAST、BUSCO和Samtools评估基因组；ResFinder和BLASTn筛查获得性耐药基因及染色体点突变，ABRicate联合毒力因子数据库（Virulence Factor Database, VFDB）筛查毒力相关基因；肉汤微量稀释法测定9种抗菌药MIC，按欧洲抗菌药物敏感性试验委员会流行病学折点（epidemiological cutoff values, ECVs）判读，并以Cohen’s Kappa统计量评估基因型-表型一致性。

研究结果如下。基因组特征：通过WGS和质控分析，3,628株初始分离株经筛选后2,783株纳入最终分析，其中2018年912株、2019年739株、2020年484株、2021年648株；2,739株来自粪便或直肠拭子，10株来自血液，34株来自其他标本类型。组装基因组平均GC含量30.4%，平均长度1,677,537 bps，平均完整度98.8%，平均覆盖度57.8×。毒力因子筛查：通过ABRicate/VFDB分析，细胞黏附与侵袭相关基因cadF和flaC存在于全部2,783株；CDT基因cdtA、cdtB、cdtC、应激防御基因rpoN、htrB及ciaC、jlpA存在于95%以上分离株，ciaB存在于75.2%；flaA和flaB分别见于24.7%和28.5%的分离株；IV型分泌系统（Type IV secretion system, T4SS）相关基因低于6%。基因型抗菌药物耐药：通过ResFinder和BLASTn分析，共识别25种获得性耐药基因和9种染色体点突变；2,571株（92.4%）至少携带一种获得性耐药基因或点突变，212株（7.6%）基因型全敏感；2,520株（90.5%）至少携带一种获得性耐药基因，837株（29.7%）至少携带一种AMR相关点突变。获得性基因中以bla_OXA-61最常见（64.2%），并常见多种bla_OXA基因，包括bla_OXA-193、bla_OXA-450、bla_OXA-451、bla_OXA-453和bla_OXA-489；tet(O)次之（52.8%），并检出嵌合基因tet(O/32/O)（3.2%）和tet(O/W/32/O)（0.08%）；氨基糖苷类基因以aph(3′)-III最常见（11%），aph(2″)-If见于7株。点突变以gyrA突变为主（821株，占837株点突变分离株的98.1%），T86I最常见（811株，96.8%），并见T86I + D90N、T86I + P104S、T86A和T86V；23S rRNA点突变见于53株（6.3%），rpsL点突变见于4株。表型抗菌药物耐药：通过547株子集的肉汤微量稀释法AST分析，218株（40%）对所有受试抗菌药全敏感；四环素耐药最常见（286株，52.3%），其次为喹诺酮类（168株，30.7%）、大环内酯类（13株，2.4%）、林可酰胺类（lincosamides，13株，2.4%）、氨基糖苷类（10株，1.8%）和酰胺醇类（phenicols，4株，0.7%）；1株对环丙沙星耐药但对萘啶酸敏感。19株（3.5%）为多重耐药（MDR，对三类及以上抗菌药物类别耐药），最常见MDR模式为AZM-CIP-CLI-ERY-NAL-TET（6株），5株MDR分离株对五类抗菌药耐药。趋势分析显示，环丙沙星耐药（OR = 0.80，95% CI 0.68–0.94，校正P = 0.038）和萘啶酸耐药（OR = 0.81，95% CI 0.69–0.95，校正P = 0.038）随分离年份显著下降；四环素耐药OR = 0.86（95% CI 0.74–0.99，校正P = 0.107），校正后不显著；三种药物最大降幅见于2019–2020年，但逐年比较均不显著。表型与基因型AMR谱比较：通过Cohen’s Kappa分析，各抗菌药类别总体一致性较高，平均Kappa为0.89；共发现24处不一致，其中21处为表型耐药而缺乏已知耐药基因或点突变，四环素11处、喹诺酮类5处、林可酰胺类3处、氨基糖苷类3处、大环内酯类2处；其余3处为携带tet(O)但表型对四环素敏感，MIC低于1 μg/mL；3株存在不止一处不一致，例如SRR7750849表型对四环素和环丙沙星耐药，但缺乏gyrA点突变和四环素耐药基因。

讨论部分总结：作者指出，超过97%的明尼苏达临床分离株携带CDT基因cdtA、cdtB和cdtC，CDT可诱导DNA损伤并导致细胞死亡、损害肠上皮完整性；Abuoun et al.曾不常见地从临床粪便中恢复CDT阴性空肠弯曲菌，提示除CDT外还有其他机制可引起临床症状；其他研究亦报道CDT基因高流行。仅约四分之一分离株携带flaA和flaB，作者引用Panzenhagen et al.的类似结果，并提及同源重组和基因内重组可能是低流行率的解释；尽管许多菌株未检出flaA和/或flaB，多数分离株仍携带其他毒力基因，作者认为部分菌株可能是高度独特且适应临床的谱系。T4SS基因仅约5%分离株携带；Wysok et al.报道virB11缺失仅轻度降低HeLa细胞侵袭，而iam缺失显著降低侵袭，且virB11在鸡和人源空肠弯曲菌中流行率低，作者认为virB11可能不是人类弯曲菌病的关键毒力相关因子，但其体内作用仍不确定。基因型AMR方面，29%分离株携带gyrA点突变，与NARMS报告的人源和零售鸡肉喹诺酮耐药空肠弯曲菌流行率相近；T86I最常见，D90N和P104S与T86I共同检出，作者讨论D90N与中等氟喹诺酮耐药相关、P104S单独见于表型敏感株且需T86I才表型耐药，逐步积累gyrA点突变是否影响耐药水平尚不清楚。β-内酰胺耐药基因高流行，但弯曲菌对β-内酰胺和窄谱头孢菌素固有耐药，氨苄西林等β-内酰胺类在弯曲菌病治疗中应用有限；作者指出WGS有助于理解耐药调控机制，例如bla_OXA-61上游单核苷酸突变可能调节其表达，而携带bla_OXA-61的家禽分离株可对氨苄西林敏感。四环素耐药标志物见于50%以上分离株，tet(O)最常见，嵌合tet基因具有功能并介导四环素耐药；PCR法需已知靶序列，可能低估tet耐药，WGS可改善对嵌合四环素基因流行率和多样性的认识。AST子集与WGS预测比较显示，表型喹诺酮耐药约30%、四环素耐药约52%，且环丙沙星、萘啶酸和四环素耐药在研究期间下降，四环素趋势不显著；作者提及最大降幅在2019–2020年，可能反映COVID-19大流行相关暴露变化，喹诺酮耐药更常与国际旅行相关感染有关，CDC COVID-19 AMR报告亦描述2019至2020年弯曲菌对环丙沙星或阿奇霉素敏感性下降的分离株减少10%。24处不一致中多数为表型耐药而缺乏已知遗传标志物，作者认为可能归因于测序伪影或未知耐药机制；cmeABC外排泵在弯曲菌耐药中重要，cmeA表达增加可导致四环素和环丙沙星耐药增加，需进一步研究cmeA表达与表型喹诺酮耐药及已知遗传决定因素的关系；3株携带tet(O)但表型敏感、四环素MIC ≤0.25 μg/mL，作者指出tet(O)可位于质粒而非染色体，可能未表达。总体而言，作者认为基因型AMR预测与表型耐药高度一致，NARMS已将WGS用于包括沙门菌和弯曲菌在内的肠道细菌AMR预测，但WGS方法、生物信息学工具和AMR参考数据库的标准化仍有必要。

研究结论翻译：总之，研究人员的研究识别出关键毒力相关因素（如产CDT基因）的高流行，并揭示了耐药基因的遗传多样性，尤其是与β-内酰胺耐药相关的基因。四环素类和喹诺酮类的基因型与表型AMR谱之间检测到高度相关性，但发现的不一致提示研究人员对耐药机制的理解可能存在缺口或当前测序技术存在局限性。这些发现凸显了WGS在增进对空肠弯曲菌AMR和毒力理解方面的效用。重要的是，本研究为明尼苏达州4年间收集的空肠弯曲菌群体中AMR分布和基因型-表型一致性提供了区域基线。区域监测在识别时间趋势、发现新出现的耐药模式以及生成可与国家监测数据库比较的群体水平数据方面具有重要作用。总体而言，将WGS纳入常规、基于人群的AMR监测可提高检测和管理食源性病原体抗菌药物耐药的能力。