更新CDC流感A(H3)亚型分型检测：提升对当代A(H3N2)病毒及subclade K病毒的检测灵敏度

《Journal of Clinical Microbiology》：Update to the CDC influenza A(H3) subtyping assay for improved detection of influenza A(H3N2) viruses, including subclade K viruses

　　

流感A(H3N2)病毒在全球传播并引起呼吸道疾病。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的美国疾病控制与预防中心（CDC）人流感病毒实时RT-PCR（real-time RT-PCR）流感A（H3/H1pdm09）亚型分型检测用于季节性流感A病毒的亚型分型。然而，H3反向引物区域出现的新发突变引发了对当代流行病毒检测灵敏度降低的担忧。研究人员通过重新设计反向引物以靶向血凝素（hemagglutinin, HA）基因更保守区域，并对正向引物和探针进行微小调整，更新了H3检测。使用培养流感病毒、合成RNA和非流感呼吸道病原体组合进行了分析灵敏度、包容性和排他性评估。使用季节性A(H3N2)残留呼吸道标本评估临床性能。更新后的检测（H3_v2）显示分析灵敏度与初始H3检测相当或更优，检测限约为10^1.7–10^2.1 EID₅₀/mL，每个反应5拷贝RNA。对于反向引物含A21G与T23G、T23C或T23A双错配的病毒观察到性能改善，初始H3与H3_v2检测之间具有可测量的Ct（循环阈值）值偏移。该检测在139份临床标本中与预期结果100%一致，且与其他流感亚型或其他呼吸道病原体无交叉反应。这些发现表明，更新后的H3_v2检测提高了对当代和新发季节性A(H3N2)病毒的灵敏度，同时保持高特异性。该更新确保对季节性A(H3N2)（包括基因漂移的A(H3N2)病毒，如近期出现的A(H3N2) subclade K（亚分支K）病毒）的持续可靠检测，并支持全球流感监测和诊断准备。

A(H3N2)（甲型H3N2流感病毒）自1968年进入人群，是全球主要流行流感病毒之一，与其他季节性流感病毒亚型或谱系相比进化更快，常与较严重流行相关，并可在人与猪之间双向传播。流感监测需要准确检测和亚型分型。CDC分发的体外诊断（IVD）单重实时逆转录聚合酶链反应（rRT-PCR）检测组合中，流感A亚型分型试剂盒用于区分A(H1N1)pdm09与A(H3N2)，其中H3检测靶向HA基因高度保守区。问题在于，2020年出现的A(H3N2) 3C.2a1b.2a分支在H3反向引物靶区含A21G错配，至2021年底已见于96%的全球流行A(H3N2)病毒；研究人员还发现该错配可与T23G等附加错配共存，导致接近检测限（LoD）的病毒检测灵敏度下降。因此，有必要重新设计H3检测以恢复并提升对当代A(H3N2)的检测能力。研究人员将反向引物移至HA基因更保守且更靠近探针的区域，并对正向引物和探针引入混合碱基，形成H3_v2，系统评价其分析灵敏度、包容性、排他性、临床性能和序列错配。结论是H3_v2在保持高特异性的同时恢复并提高对含关键反向引物错配病毒及subclade K（亚分支K）病毒的检测灵敏度，对国内和全球流感监测、诊断准备及病毒学监测具有意义。

关键技术方法：研究人员基于GISAID（全球共享流感数据倡议组织）序列重新设计H3_v2正向引物、反向引物及双淬灭TaqMan探针，并用PrimerExpress评估退火温度；采用培养的A(H3N2)病毒、含A/Darwin/09/2021 HA的合成RNA及呼吸道病原体组合评价分析灵敏度和特异性；在ABI 7500 Fast Dx实时RT-PCR系统上检测；临床性能采用来自多个监测点的139份残留上呼吸道标本（2019—2025年，含79份H3阳性、19份subclade K及60份H3阴性）；并对GISAID 2025-08-01至2026-06-30的35,400条subclade K HA序列作in silico（计算机模拟）错配分析。

研究结果：1. H3_v2 assay update（H3_v2检测更新）：通过将探针T13Y、正向引物C13Y更新，并新设计反向引物靶向更保守区域，同时维持55°C退火以兼容潜在错配，形成H3_v2；热梯度分析支持该退火温度，结论是更新设计可应对近期流行序列的错配。2. Analytical sensitivity（分析灵敏度）：用两株A(H3N2)病毒系列稀释及合成RNA评价，H3_v2检测限约为10^1.66–10^2.12 EID₅₀/mL（每反应10^?0.64–10^?0.18 EID₅₀），可检出每反应5拷贝RNA，结论为灵敏度与初始H3相当或更优。3. Analytical specificity（分析特异性）：包容性评价中，9株季节性A(H3N2)（含1株subclade K）和5株A(H3)v（H3变异株）显示H3_v2相当或更优；A/Massachusetts/10/2021（A21G+T23G）Ct值降低超过10，A/Wisconsin/114/2025（A21G+T23C）亦显著改善；排他性评价中，其他流感亚型、B型、C型及39种非流感呼吸道病原（20种病毒、19种细菌）无交叉反应，包括SARS-CoV-2，结论为H3_v2对A(H3N2)和A(H3)v特异。4. Performance with clinical specimens（临床标本性能）：139份标本中H3_v2与预期结果100%一致（79/79阳性、60/60阴性）；含A21G+T23G、T23C或T23A双错配的20份标本（含19份subclade K）Ct值改善超过7；60份H3阴性标本在H3_v2和InfA检测中均阴性，结论为临床灵敏度和特异性高。5. In-silico analysis of primers and probes mismatches among A(H3N2) subclade K viruses（A(H3N2) subclade K病毒引物和探针错配的计算机模拟分析）：对35,400条subclade K HA序列分析显示，H3_v2各靶区无错配比例约94.99%—98.23%，少数病毒含2或3个错配；H3探针区单错配占96.42%，H3反向引物区双错配占97.51%，结论为这些错配仍需进一步评估其对检测性能的潜在影响。

讨论部分总结：H3_v2分析灵敏度与错配病毒出现前的初始H3相当，检测限低至10^1.66–10^2.12 EID₅₀/mL，并能检出5拷贝RNA；包容性显示对含A21G与T23C、T23A或T23G双错配病毒明显改善，对A(H3)v亦相当或改善；排他性显示无交叉反应。临床标本进一步证实高灵敏度和高特异性，双错配标本出现显著Ct值差异，提示初始H3在多重反向引物错配时灵敏度下降。A21G自2021年以来超过96%，单一A21G影响不显著，但与T23G、T23C或T23A组合时灵敏度下降，且A21G+T23C至2026年中期已超过85%，故检测更新必要。探针T13Y更新兼顾近99%人季节性A(H3N2)的T13C错配与A(H3)v在该位点常为T的情况。BHQ与ZEN双淬灭探针、Quanta qScript与Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step体系结果相当。自2025年8月以来subclade K快速增加并在2025/26季节占优势，含双错配病毒均属subclade K，H3_v2对培养病毒和20份subclade K临床标本显示更优灵敏度，in silico未见值得担忧的错配模式。H3检测于2008年获FDA批准并服务16年以上，H3_v2于2024年获FDA批准；自2025年3月起含H3_v2引物和探针的CDC Influenza A Subtyping Kit（Ver 4）已部署至Public Health Laboratories（公共卫生实验室）。研究结论翻译：更新后的H3_v2检测提高了对季节性A(H3N2)病毒和A(H3)v病毒的灵敏度并保持特异性，包括对近期出现的A(H3N2) subclade K病毒的检测，从而支持监测和诊断应用，并将继续支持国内和全球流感监测与诊断准备。