《Journal of Clinical Microbiology》：Comparative plaque- and liquid-based phage susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates in a cystic fibrosis randomized clinical trial
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噬菌体敏感性检测（phage susceptibility testing, PST）的最佳方法尚不明确。在此，研究人员利用从囊性纤维化患者中分离的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分离株比较了两种PST方法，这些患者入组了一项关于单
噬菌体敏感性检测（phage susceptibility testing, PST）的最佳方法尚不明确。在此，研究人员利用从囊性纤维化患者中分离的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分离株比较了两种PST方法，这些患者入组了一项关于单次静脉注射四噬菌体鸡尾酒（WRAIR-PAM-CF1）的安慰剂对照临床试验。共评估了508株铜绿假单胞菌痰液分离株，包括在噬菌体或安慰剂治疗前后采集的分离株、同一试验参与者不同时间点的分离株，以及同一参与者同一时间点不同菌落形态的分离株。使用噬斑法（plaque assay, PA）和基于Biolog Omnilog的液体法（liquid assay, LA），以相同的细菌接种物评估了对噬菌体PaWRA01Φ11、PaWRA01Φ39、PaWRA02Φ83、PaWRA02Φ87及其四噬菌体鸡尾酒的敏感性。通过PA和LA分别鉴定出170/508（33%）和195/508（38%）的分离株对鸡尾酒敏感。在敏感分离株中，169/170（99%；PA）和187/195（96%；LA）对鸡尾酒中至少一种噬菌体也呈敏感。对于所有研究的噬菌体及鸡尾酒，PA与LA之间的敏感百分比一致性范围为76%至100%，非敏感百分比一致性范围为89%至100%。噬菌体PaWRA02Φ83表现出最强的单一活性，通过PA和LA分别有164/508（32%）和188/508（37%）分离株检测为敏感。四噬菌体鸡尾酒对铜绿假单胞菌的覆盖范围在数值上比任何单一噬菌体更广（即具有最高的敏感率）。PA和LA的PST结果之间存在高度一致性。
重要性：噬菌体敏感性检测（PST）方法的标准化对于支持噬菌体治疗试验及未来任何临床实施至关重要。目前尚无标准化的PST方法或判读标准。在本研究中，研究人员对入组临床试验的囊性纤维化患者中分离的铜绿假单胞菌，采用噬斑法和基于Biolog Omnilog的液体法进行PST。评估了508株分离株对四种噬菌体及其组成的鸡尾酒的敏感性。噬斑法和液体法评估的敏感性之间具有高度一致性，且鸡尾酒对铜绿假单胞菌的覆盖范围在数值上比任何单一噬菌体更广。本手稿应引起PST研究人员的兴趣。
抗生素耐药性危机促使人们重新关注噬菌体（bacteriophage, phage）疗法。为了支持噬菌体治疗的临床试验和未来的临床应用，需要标准化的噬菌体敏感性检测（phage susceptibility testing, PST）方法。常规抗生素药敏试验已有标准化流程，但PST目前缺乏统一的检测方法和判读标准。此外，当使用噬菌体鸡尾酒时，评估各噬菌体之间的协同或拮抗可能有助于优化方案，而直接从鸡尾酒层面进行检测可能更具操作可行性。为此，研究人员在针对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）定植的囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者开展的一项随机临床试验中，同时对分离株进行基于噬斑法（plaque assay, PA）和基于Biolog Omnilog的液体法（liquid assay, LA）检测，以比较两种PST方法的一致性及鸡尾酒的覆盖范围。
研究人员利用ARLG PHAGE试验中从CF患者痰液分离的铜绿假单胞菌分离株，该试验为一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的噬菌体鸡尾酒（WRAIR-PAM-CF1）单次静脉给药试验。样本来自17个研究中心，送至加利福尼亚大学圣迭戈分校分离确认，最终共508株可供分析。研究评估了四种噬菌体（PaWRA01Φ11、PaWRA01Φ39、PaWRA02Φ83、PaWRA02Φ87）及四噬菌体鸡尾酒的敏感性。PA采用双层琼脂点种法，按0-4级评分，2-4级判定为敏感；LA使用Biolog Omnilog监测细菌代谢活性，以细菌生长抑制时间（hold time）≥4小时为敏感。初始检测后，结果不一致的分离株重复检测两次，最终结果以三次中两次一致为准。主要统计指标为敏感百分比一致性（susceptible percent agreement, SPA）和非敏感百分比一致性（non-susceptible percent agreement, NSPA），并计算95%置信区间。
研究结果如下：
1. 对单个噬菌体和四噬菌体鸡尾酒的敏感性
通过最终PA，33%（170/508）的分离株对鸡尾酒敏感，最终LA为38%（195/508）。单个噬菌体中，PaWRA02Φ83活性最强（PA 32%，LA 37%），其次为PaWRA02Φ87（20%，21%）、PaWRA01Φ11（9%，12%），PaWRA01Φ39最低（4%，5%）。这表明鸡尾酒比任何单一噬菌体提供更广的数值覆盖。
2. 单个噬菌体与鸡尾酒敏感性的比较
在最终PA判定为鸡尾酒敏感的170株中，169株（99%）至少对一种单个噬菌体敏感；LA中195株敏感，其中187株（96%）如此。相反，鸡尾酒不敏感时，98%（PA）和94%（LA）的分离株对所有单个噬菌体均不敏感。因此，鸡尾酒的结果基本反映了单个噬菌体的综合作用。
3. 初始与最终检测的一致性
初始PA和LA的总体一致性在81-94%之间，重复测试后最终一致性提高到90-99%。其中PaWRA01Φ39一致性最高（初始94%，最终99%），鸡尾酒最低（初始81%，最终90%）。重复检测可提高方法间的一致性。
4. 最终敏感与非敏感百分比一致性
以最终PA为参考，LA的SPA范围为88%-100%，NSPA范围为89%-99%；以最终LA为参考，PA的SPA范围为76%-84%，NSPA范围为96%-100%。以PA为参考时SPA普遍较高，以LA为参考时NSPA略高。
5. 初始与最终SPA/NSPA的比较
无论以何种方法为参考，重复检测均提高了SPA和NSPA。例如，以PA为参考，LA的SPA从初始的62%-93%升至88%-100%，NSPA从80%-95%升至89%-99%。这表明对不一致结果进行复审能改善两种方法的一致性。
6. 痰培养中多种铜绿假单胞菌菌落形态的分析
在106份具有两种菌落形态的痰标本中，46对（43%）的PST结果一致，其中76%（35/46）均为对所有噬菌体和鸡尾酒不敏感。在16份具有三种形态的标本中，5份的第三种形态与第一或第二种形态结果一致，其中多数对PaWRA02Φ83和鸡尾酒敏感。这表明同一痰标本内不同菌落形态的分离株可具有不同的噬菌体敏感性。
讨论部分指出，本研究中噬菌体的覆盖范围较先前研究窄，可能由于纳入患者群体不同或包含了治疗后分离株而产生耐药。局限性包括尚无临床验证的折点、“敏感”一词可能不恰当、未与临床结局关联、未进行克隆性分析、仅评估CF痰液、鸡尾酒中各噬菌体浓度为单个的1/4等。研究结论：四噬菌体鸡尾酒WRAIR-PAM-CF1无论通过PA还是LA检测，均提供了比任何单一噬菌体更广的数值覆盖，且PA与LA的结果高度一致。然而，不到一半的分离株对鸡尾酒敏感，未来需要开发更广谱或替代性的噬菌体组合。
