《Journal of Clinical Microbiology》：Droplet digital PCR for diagnosing invasive aspergillosis in hematological malignancies: a prospective cohort study
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目的：研究人员的目的是评估呼气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中曲霉微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddP
目的：研究人员的目的是评估呼气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中曲霉微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）诊断侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis, IA）的准确性，并在血液恶性肿瘤患者中将其性能与定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）进行比较。研究人员于2021年10月至2024年12月开展了一项前瞻性单中心研究，纳入入住白血病和异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplant, allo-HSCT）单元、因肺部浸润接受支气管镜检查的成人。EBC和BALF同步采集。对EBC及BALF（上清液和细胞沉淀）行ddPCR；对BALF样本行qPCR。IA依据欧洲癌症研究与治疗组织/真菌病研究组教育与研究联盟（EORTC/MSGERC）标准分类，未将PCR纳入参考标准。计算诊断性能特征，包括受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC-ROC）。在203例参与者中，26例（12.8%）被诊断为很可能（probable）或确诊（proven）IA。EBC ddPCR表现较差（AUC-ROC 0.55，95% CI 0.43–0.67）。BALF上清液ddPCR表现最佳（AUC-ROC 0.88，95% CI 0.80–0.96），敏感度为0.65（95% CI 0.43–0.84），特异度为0.96（95% CI 0.92–0.99）。对于ddPCR和qPCR，BALF上清液均优于BALF细胞沉淀检测。与qPCR相比，ddPCR显示出更高的敏感度和相似的高特异度。在既往未接受抗霉菌活性（mold-active）抗真菌治疗的参与者中，BALF上清液ddPCR表现改善（AUC-ROC 0.95，95% CI 0.89–1.00）。在这项大型前瞻性研究中，EBC ddPCR对IA诊断的效用有限。BALF上清液是最佳标本类型，且ddPCR优于qPCR。在既往未暴露于抗霉菌活性抗真菌治疗时，诊断性能显著改善。重要性：IA在血液恶性肿瘤患者中难以诊断，需要非侵入性诊断方法。在这项纳入203例患者的前瞻性研究中，曲霉ddPCR在EBC中表现较差（AUC-ROC 0.55；95% CI 0.43–0.67），但在BALF上清液中显示出良好的诊断性能（AUC-ROC 0.88；95% CI 0.80–0.96）。ddPCR较定量PCR显示出更高的敏感度，同时具有相似的高特异度，且BALF上清液始终优于细胞沉淀检测。在既往未接受抗霉菌活性抗真菌治疗的患者中，AUC-ROC为0.95（95% CI 0.89–1.00）。这些发现支持将BALF上清液作为曲霉ddPCR的首选标本，并值得进一步评估该方法用于IA诊断。
研究背景：尽管抗霉菌活性抗真菌预防广泛使用后侵袭性真菌感染流行病学发生变化，侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis, IA）仍是血液恶性肿瘤（hematological malignancies）患者中最常见的侵袭性真菌感染，且尽管诊断和治疗进步，死亡率仍持续较高；早期诊断重要，临床指南强调对IA患者及时启动抗真菌治疗。当前IA诊断方法仍不理想：BALF中半乳甘露聚糖（galactomannan, GM）敏感度约75%–86%、特异度92%–100%，曲霉PCR敏感度57%–91%、特异度92%–99%；血液标志物敏感度普遍较低，血清GM约76%，血曲霉PCR为57%–84%，血清β-D-葡聚糖诊断价值不明确且研究间差异大。EBC用于真菌诊断的研究结果不一，既往多聚焦GM或真菌相关挥发性有机化合物；研究人员此前报道过EBC中基于PCR的曲霉检测作为白血病患者监测工具，而非用于肺部浸润患者IA诊断。微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）可能较常规PCR具有更高敏感度、无需标准曲线的绝对定量及更好耐PCR抑制剂等优势，可能适用于EBC等低载量临床标本。因此研究人员旨在评估EBC和BALF中曲霉ddPCR诊断IA的准确性，并与定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）比较。
研究人员开展了一项前瞻性单中心研究，纳入因肺部浸润行支气管镜的血液恶性肿瘤成人，最终分析203例，其中26例（12.8%）为很可能或确诊IA；结论为EBC ddPCR诊断效用有限，BALF上清液ddPCR总体诊断性能最佳且优于BALF细胞沉淀，ddPCR较qPCR敏感度更高而特异度相似，既往未接受抗霉菌活性抗真菌治疗者BALF上清液ddPCR诊断性能明显改善。其意义在于支持BALF上清液作为曲霉ddPCR首选标本，并提示临床可行时应在抗真菌治疗前获取呼吸道样本，同时BALF ddPCR的性能和阈值仍需外部验证。
关键技术方法：研究为2021年10月至2024年12月在加拿大多伦多Princess Margaret Cancer Center白血病或异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）单元开展的前瞻性单中心队列，纳入因肺部浸润行支气管镜的连续成人，最终分析203例。同步采集呼气冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）与支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF），BALF离心分为无细胞上清和细胞沉淀；对EBC、BALF上清及细胞沉淀行曲霉ddPCR，对BALF行qPCR；以EORTC/MSGERC标准（不纳入PCR）判定很可能或确诊IA；采用受试者工作特征（ROC）曲线和Youden指数确定ddPCR阈值，计算曲线下面积（AUC）、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及似然比；并进行排除采样前7天内抗霉菌活性抗真菌治疗的敏感性分析。
研究结果：
研究队列：基于前瞻性连续入组和图表复核，452例符合条件，206例同意并接受219次支气管镜，3例无可用呼吸道标本被排除；203例参与者中26例（12.8%）为很可能或确诊IA（25例很可能，1例确诊），诊断主要依据BALF GM阳性（20/26，76.9%），6例培养阳性（4例Aspergillus fumigatus，2例A. niger）；IA患者从血液恶性肿瘤诊断至支气管镜的间隔长于无IA者（中位244.50天 vs 91.00天，P=0.030）。队列中位年龄63.00岁，男性67.0%，急性髓系白血病75.4%，既往allo-HSCT 29.6%，支气管镜时69.0%正在接受化疗。
ddPCR的ROC曲线和阈值分析：通过ROC曲线分析，EBC ddPCR判别能力差，AUC 0.55（95% CI 0.43–0.67），Youden指数最佳阳性阈值为0.63 copies/20 μL；BALF上清液ddPCR判别能力良好，AUC 0.88（95% CI 0.80–0.96），最佳阈值6.14 copies/20 μL；BALF细胞沉淀ddPCR判别能力中等，AUC 0.69（95% CI 0.56–0.82），最佳阈值3.12 copies/20 μL；BALF上清液和细胞沉淀qPCR的AUC分别为0.77（95% CI 0.67–0.87）和0.58（95% CI 0.49–0.67）。
ddPCR与qPCR的诊断性能：基于上述阈值计算诊断性能，EBC ddPCR敏感度0.67（95% CI 0.45–0.84）、特异度0.45（95% CI 0.37–0.53），假阳性率高；BALF上清液ddPCR总体最佳，敏感度0.65（95% CI 0.43–0.84）、特异度0.96（95% CI 0.92–0.99），BALF细胞沉淀ddPCR敏感度0.42（95% CI 0.22–0.63）、特异度0.92（95% CI 0.87–0.96）；qPCR同样显示BALF上清液优于细胞沉淀，上清液qPCR敏感度0.57、特异度0.98，细胞沉淀qPCR敏感度0.17、特异度1.00；ddPCR较qPCR在上清液中敏感度更高（0.65 vs 0.57）而特异度相似（0.96 vs 0.98）；联合BALF上清液和细胞沉淀仅带来有限增量，ddPCR联合使敏感度由0.65升至0.70但特异度由0.96降至0.89，qPCR联合与单用上清液性能相同；采用优先敏感度或优先特异度的替代阈值时，BALF上清液ddPCR在优先敏感度阈值下敏感度0.91、特异度0.66，在较高特异度阈值（3.91 copies/20 μL）下敏感度0.70、特异度0.90。
敏感性分析：通过限制采样前7天内未接受抗霉菌活性抗真菌治疗的参与者，BALF上清液检测总体性能改善，BALF上清液ddPCR的AUC为0.95（95% CI 0.89–1.00），敏感度0.83（95% CI 0.52–0.98）、特异度1.00（95% CI 0.95–1.00）；BALF上清液qPCR敏感度0.67（95% CI 0.35–0.90）、特异度1.00（95% CI 0.95–1.00）；EBC ddPCR在该限制队列中仍表现有限；限制于EBC体积≥0.5 mL的样本时，EBC ddPCR诊断性能与全队列相当。
讨论部分总结：研究人员认为，EBC作为非侵入、低风险采样方法具有潜在吸引力，但本研究中EBC ddPCR仅中等敏感度且特异度差，对排除或确认IA的总体效用有限；EBC与BALF的生物学和采集差异可能解释其表现，BALF直接采样下呼吸道，而EBC受冷凝水蒸气显著稀释（文献估计气道衬液稀释20至30,000倍），可致可提取曲霉DNA量常低于检测限；EBC采集依赖患者配合并可增加采样变异，且更易受上气道污染而降低特异度；EBC与BALF均冷冻后用同一曲霉引物探针集分析，故差异不太可能反映实验室处理。BALF上清液持续优于细胞沉淀，与既往研究中无细胞BALF组分更易检出真菌DNA的发现一致；ddPCR较qPCR敏感度更高，可能与其将样本分配至数千个反应以分离低丰度靶标、基于终点检测而非扩增动力学因而受扩增效率和抑制剂影响较小有关。既往研究提示支气管镜前抗霉菌活性治疗降低BALF PCR敏感度，本研究中无既往抗霉菌活性治疗者诊断性能显著改善，支持临床可行时在抗真菌治疗前行支气管镜。局限性包括单中心三级癌症中心及机构特异性预防实践限制外推、仅26例IA导致部分分析置信区间宽、较多参与者采样前已接受抗霉菌活性治疗可能降低真菌负荷和敏感度、部分检测数据缺失（尤其BALF细胞沉淀qPCR）、54.4%符合条件者因后勤限制或不同意未入组而可能存在选择偏倚、ddPCR阳性阈值内部推导需外部验证、pan-Aspergillus检测不提供种水平鉴定或唑类耐药检测；但大样本、前瞻性设计、连续入组及ddPCR/qPCR结果未纳入参考标准增强了结果有效性。
研究结论部分翻译：总之，在这项因肺部浸润接受支气管镜的血液恶性肿瘤患者的大型前瞻性队列中，BALF上清液是诊断IA的最佳样本，ddPCR总体诊断性能高于qPCR。既往未暴露于抗霉菌活性抗真菌治疗时诊断性能进一步提高，强调临床可行时在启动抗真菌治疗前获取呼吸道样本的重要性。相反，EBC ddPCR因总体诊断性能差而临床效用有限。在更广泛临床实施前，BALF ddPCR的诊断性能和阳性阈值应在外部队列中验证。
