《Biophysica》：Food-Derived microRNAs in Human Health: Bioavailability, Cross-Kingdom Regulation, Biomarker Potential and Applications in Functional Foods and Precision Nutrition
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摘要
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类长度为19–24个核苷酸的小型非编码RNA，通过转录后水平调控基因表达，在维持细胞稳态和人类健康中发挥基础性作用。其疾病特异性表达谱已确立其作为癌症、感染性疾病、心血管疾病、神经系统疾病及代谢性疾病诊断
摘要
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类长度为19–24个核苷酸的小型非编码RNA，通过转录后水平调控基因表达，在维持细胞稳态和人类健康中发挥基础性作用。其疾病特异性表达谱已确立其作为癌症、感染性疾病、心血管疾病、神经系统疾病及代谢性疾病诊断、预后和治疗监测中颇具前景的生物标志物。近年来，研究人员已在多种植物源、动物源及微生物源食物中鉴定出miRNAs，这引发了对其作为具有生物活性的膳食分子、在口服摄入后能够调节人体生理功能的潜在作用的关注。本综述总结了当前关于食物来源miRNAs、其生物学功能、跨界调控活性及治疗潜力的研究进展。为实现这一目标，研究人员在PubMed、Web of Science和Scopus数据库中检索了2000年1月至2026年5月期间发表的相关文献，并采用与食物来源miRNAs、跨界调控、稳定性机制及先进生物传感平台相关的关键词进行文献检索，重点关注经同行评审的实验性和临床研究。除miRNAs的生物学作用外，本综述还重点阐述了决定miRNA稳定性的结构和生物物理决定因素，包括二级结构、热力学性质、Argonaute（AGO）蛋白相互作用、细胞外囊泡封装以及影响其持久性、转运、生物利用度和调控活性的生物分子组装体。此外，本文还讨论了纳米材料生物传感器、电化学传感、CRISPR诊断、超分辨成像及微流控分析平台在miRNA检测和定量方面的最新进展。尽管越来越多的证据支持膳食miRNAs的生物学相关性，但其在食品加工和胃肠道消化过程中的稳定性、吸收、体循环转运以及在人体中生物活性的明确证实等方面仍面临重要挑战。总体而言，本综述强调了食物来源miRNAs在精准营养、生物标志物发现、功能性食品开发及RNA治疗中的潜在应用价值，同时强调需要标准化的分析方法、机制验证和严格的临床研究以促进未来的转化应用。
2. 膳食微小RNA（Dietary miRNAs）
2.1 膳食微小RNA：来源与健康益处
膳食微小RNA（dietary miRNAs）是一类已在水果、蔬菜、谷物、豆类、肉类和乳制品等多种食物中鉴定出的内源性小型非编码RNA分子。与主要通过代谢提供能量或作为结构和生化底物的常规膳食营养素不同，膳食miRNAs被提出可通过与基因表达通路相互作用，在分子水平发挥调控作用。摄入后，膳食miRNAs必须克服多种生理屏障，包括胃部酸性环境、消化酶、胆汁盐及胃肠道其他组分。尽管面临这些挑战，部分研究报道某些食物来源miRNAs可能在消化过程中保持足够稳定，从而通过肠上皮被吸收并在循环系统中被检测到。进入血液后，这些miRNAs可能被转运至不同组织和器官，与互补的信使RNA（mRNAs）相互作用并影响转录后基因调控。然而，膳食miRNAs是否以足以在人体组织中产生具有生物学意义效应的数量被吸收，仍不确定并持续受到研究关注。
食物组学（foodomics）领域的不断发展进一步凸显了miRNAs作为膳食生物活性分子和疾病相关生物标志物的潜在重要性。根据miRBase v22数据库，目前已从1917个前体发夹结构注释了2654个成熟人类miRNA序列，大量miRNAs已被研究作为人类疾病的潜在生物标志物。由于miRNAs可调控多个基因并参与广泛的生理和病理过程，其表达谱的改变与癌症、心血管疾病、代谢紊乱、炎症及其他慢性疾病相关。 miRNAs在生物体液中的相对稳定性也增强了其作为微创生物标志物的应用潜力。近期研究扩展了对膳食miRNAs独特特征的认识，特别是其在食品加工和胃肠道消化过程中的稳定性、肠道吸收机制、向靶组织的转运和递送，以及对基因表达的潜在调控作用。多项研究提出，膳食miRNAs可能通过与细胞外囊泡、脂蛋白、RNA结合蛋白或其他食物来源的分子结构结合而免受降解。此类保护机制可能促进其在消化过程中的存活，并有助于随后被肠道细胞摄取。然而，不同研究之间在膳食miRNAs的丰度、稳定性、生物利用度和组织分布方面存在显著差异，表明这些过程可能受食物组成、加工条件、miRNA序列和结构以及个体生理特征的影响。
重要的是，实验研究表明膳食miRNAs的吸收可能遵循特征性动力学模式，而非简单的被动扩散。既往研究报道了膳食暴露后循环miRNA浓度的时间依赖性变化，产生与调控或生物介导摄取过程一致的吸收曲线。这些观察结果支持了膳食miRNAs的摄取可能代表一个涉及肠道吸收、转运、细胞摄取及随后与分子靶标相互作用的真实代谢过程的假说。然而，这些观察结果的生物学意义及膳食miRNAs摄取和系统分布的机制仍需进一步验证。
新兴证据表明食物来源miRNAs可在人体系统中具有生物活性。例如，Lukasik和Zielenkiewicz开展的一项研究在哺乳动物乳汁外泌体中鉴定出35种外源miRNAs，其中25种来源于植物，尽管该研究为计算机模拟再分析，但提出了膳食miRNAs介导调控的可能性。类似地，膳食组分的表观遗传效应也已有报道。Ozyalcin和Sanlier的研究表明，白藜芦醇、硒和异硫氰酸盐等生物活性膳食组分可通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等表观遗传修饰，单独或常与多种膳食组分联合预防和治疗多种癌症类型。研究还发现，含有生物活性化合物的饮食可促进生物过程的调节，而不仅仅提供能量和营养素。Zhou等人的研究发现，生物活性化合物白藜芦醇可显著降低急性淋巴细胞白血病细胞系中miR-196b/miR-1290的过表达并升高IGFBP3表达，表明其具有潜在抗肿瘤特性。
尽管有这些令人鼓舞的发现，食物来源miRNAs的研究仍处于相对早期阶段，许多新型miRNAs尚待鉴定和功能表征。其生物学意义的研究在机制和方法学层面均受到质疑。当前证据表明，食物来源miRNAs在多种组织的基因调控中至关重要，为癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等疾病提供了潜在治疗应用。
2.2 膳食细胞外囊泡和类细胞外囊泡纳米颗粒
除在生物体液中鉴定miRNAs外，多项研究还揭示了其在膳食外泌体中的存在。在循环过程中，血液miRNAs（血清和血浆）可附着于外泌体并释放到血液中。据Zhang等人报道，这些外泌体可将蛋白质和RNA转运至靶细胞并促进细胞间相互作用。通过保护其货物免受酶降解，外泌体作为生物信使改善远距离组织间的细胞间通讯。
根据近期研究，外泌体miRNAs可作为特定心脏相关疾病和癌症的标志物。2010年，Michael等人在人类唾液中鉴定出外泌体miRNAs，并提出其作为干燥综合征和其他唾液腺病理非侵入性生物标志物的潜在用途。外泌体miR-224已被确定为肝细胞癌（HCC）的潜在生物标志物，血清外泌体miR-224据报道可区分HCC患者与健康对照，并与疾病预后相关；实验研究还表明外泌体miR-224可促进HCC细胞增殖和侵袭。外泌体主要由脂质双层膜和多种蛋白质组成，被视为转运DNA、miRNAs和各种蛋白质等较小分子的纳米载体。
根据Ju等人2013年的一项研究，膳食来源的类外泌体纳米颗粒可能在肠道炎症中发挥治疗作用。在其葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中，口服葡萄类外泌体纳米颗粒（GELNs）可保护动物免受肠道损伤，有证据表明其被肠道巨噬细胞摄取并调节炎症细胞因子。这些发现表明植物来源囊泡可在实验条件下影响肠道免疫反应，但并不暗示抗癌活性或证明在正常膳食摄入后的等效效应。实验结果表明，葡萄类外泌体纳米颗粒可被封装、穿过肠道并到达小鼠肠道黏液层。这些纳米颗粒被肠道干细胞吸收，促进干细胞增殖和黏膜修复。该研究表明膳食外泌体可作为miRNAs等功能性RNA的载体并可能发挥治疗作用，因此被认为是潜在的有效治疗剂。
3. miRNA的结构与动力学及其生物分子组装体
miRNAs是长度约为19–24个核苷酸的短链非编码RNA，其结构和动态特性决定了其稳定性、调控特异性和生物活性。在生物合成过程中，初级miRNA（pri-miRNA）转录本折叠成不完全的茎环发夹结构，由Microprocessor复合物（Drosha–DGCR8）和Dicer依次加工生成成熟miRNA双链体。高效的Microprocessor识别需要特征性结构特征，包括约35个碱基对的双链茎、侧翼单链区域以及至少10个核苷酸的末端环，尽管这些特征本身不足以将真正的pri-miRNAs与基因组中预测的众多相似发夹结构区分开来。Dicer随后在末端环附近切割pre-miRNA，产生约22个核苷酸的双链体，切割位置由特定结构基序和茎环连接处决定。
miRNA的功能由所得双链体的结构和热力学性质决定。链选择受双链体末端热力学不对称性的支配，具有更有利的5′核苷酸和较低末端稳定性的链被优先保留为指导链，而互补的过客链通常被丢弃。实验分析表明，功能性miRNA和siRNA双链体的5′反义末端具有增强的灵活性，活性双链体在该末端比非功能性双链体表现出约0.5 kcal/mol更低的内部稳定性，从而促进双链体解旋和指导链掺入RNA诱导沉默复合物（RISC）。这些观察结果也为计算RNA折叠算法提供了信息，其中对末端碱基配对的约束可改善体内链选择和RISC装载的预测。除双链体不对称性外，核苷酸组成进一步影响miRNA稳定性，因为富含GC的miRNAs通常比GC含量较低的分子具有更强的抗降解能力。
3.1 Argonaute装载与RISC动力学
成熟miRNA诱导沉默复合物的形成是一个高度动态的过程，不仅限于简单的RNA双链体装载。在Dicer加工后，指导链被掺入Argonaute（AGO）蛋白以形成RISC，即负责序列特异性转录后基因调控的核糖核蛋白复合物。结构研究表明，Argonaute蛋白经历可逆的闭合-开放构象转变，使其能够容纳多样的miRNA-靶标双链体结构。这种构象灵活性使AGO蛋白能够容忍溶剂暴露的种子区和3′补充区内的扭曲，同时保持中心双链体区域内的严格结构约束，从而在靶标特异性和识别广泛部分互补mRNA靶标的能力之间取得平衡。
尽管人类表达四种高度保守的Argonaute旁系同源物（AGO1–AGO4），但越来越多的证据表明，尽管这些蛋白结合许多相同的miRNAs，它们仍执行不同的调控功能。Argonaute身份影响指导链选择、双链体解旋、细胞内运输、核滞留和整体miRNA稳定性，而AGO蛋白的翻译后修饰进一步调节RISC活性、靶标亲和力和复合物稳定性。此外，成熟miRNA双链体之外的结构决定因素，包括前体转录本内的远端元件，可调节AGO装载效率，突显了miRNA功能受整个前体分子结构而非仅成熟序列的影响。种子区匹配的靶标RNA还可通过保护miRNAs免于降解并促进其核滞留来稳定成熟miRNAs，而无抑制能力的miRNAs可被隔离到低分子量复合物中，提供另一层转录后调控。
3.2 稳定性、降解与周转
尽管miRNAs体积相对较小，成熟miRNAs表现出显著多样的细胞内半衰期，由其内在序列特征、结构稳定性及与RNA结合蛋白的相互作用决定。例如，miR-382的不稳定性主要由其3′末端区域内的核苷酸决定，而非种子序列，这些末端残基的突变可显著提高miRNA稳定性。在哺乳动物细胞中，降解主要由外泌体相关的3′–5′外核糖核酸酶复合物介导，而在植物中，末端2′-O-甲基化保护miRNAs免受SDN1的外切核酸酶降解，说明了维持miRNA完整性的不同进化策略。
额外的分子特征进一步调节miRNA持久性。富含GC的miRNAs通常比GC含量低的分子具有更强的抗降解能力，而较高的预测自由能与法医体液中加速降解相关，表明热力学稳定性直接有助于miRNA寿命。转录后RNA编辑，包括腺苷-肌苷（A-to-I）和胞苷-尿苷（C-to-U）转换，可通过修饰前体转录本内的单个核苷酸来改变miRNA成熟、结构稳定性和靶标特异性。此外，靶标导向的miRNA衰减（TDMD）已成为动物中的主要调控通路。miRNA与特定靶标RNA之间的广泛互补性诱导Argonaute内的结构重排，招募ZSWIM8泛素连接酶复合物，导致AGO的蛋白酶体降解、成熟miRNA的释放及其随后的核酸酶介导衰减。其他周转通路，包括TUT4/7介导的尿苷化后DIS3L2降解，进一步促进哺乳动物细胞中miRNA丰度的动态调节。
miRNA的生物活性依赖于多个分子过程，包括靶标识别、Argonaute（AGO）装载、链选择和miRNA稳定性。在小RNA双链体装载过程中，双链体两端之间的热力学不对称性有助于链选择，与热力学稳定性较低端相关的链被优先掺入沉默复合物。AGO装载后，靶标识别主要由miRNA种子区与靶标RNA内互补序列之间的相互作用决定，尽管种子区以外的配对和靶标位点的结构背景也可影响调控效率。miRNA丰度随后可通过靶标导向的miRNA降解（TDMD）进行调节，其中miRNA与特定靶标转录本之间的广泛互补性可触发miRNA-AGO复合物的降解。两项独立研究确定ZSWIM8泛素连接酶为TDMD的核心介导因子。这些分子过程在考虑膳食miRNAs时尤为重要，因为其发挥生物学效应的能力首先取决于完整分子能否在加工和胃肠道转运中存活并随后到达受体细胞。
对于膳食miRNAs，食品加工和胃肠道转运过程中的稳定性代表了生物可利用性的额外屏障。实验研究表明食品加工可改变miRNA丰度。在牛乳中，巴氏杀菌、均质化和微波处理与特定miRNAs的丢失相关，表明加工条件可影响随后摄入可用的miRNA量。摄入后，miRNAs存在于细胞外囊泡（EVs）中被提出作为提供细胞外降解保护并促进其转运的机制之一。研究乳源EVs的报道称口服给药后存在摄取和组织分布，为某些乳相关miRNAs可在消化中存活并在生物组织中被检测到提供了实验证据。然而，生物利用度不应等同于功能性基因调控。定量分析表明，miRNAs仅占EV货物的一小部分，且EV介导的miRNAs向受体细胞的递送可能效率低下，凸显了检测EV相关miRNAs与证明具有生物学意义的细胞内递送之间的重要区别。总体而言，这些发现表明膳食miRNAs的潜在活性由一系列生物屏障决定，包括食品加工和消化过程中的稳定性、降解保护、EV摄取、细胞内释放、AGO装载、靶标识别及在受体细胞内的持久性。
3.3 生物分子组装体与细胞外稳定性
除其内在二级结构和与Argonaute蛋白的结合外，miRNAs存在于多种高阶生物分子组装体中，这些组装体深刻影响其稳定性、运输和细胞间通讯。在细胞内，成熟miRNAs维持在含Argonaute的核糖核蛋白复合物中，保护其免受核酸酶降解，同时实现高效基因调控。在细胞外，内源性miRNAs经常被封装在细胞外囊泡内，包括外泌体和微囊泡，或与RNA结合蛋白和脂蛋白（如高密度脂蛋白HDL）结合，共同在循环过程中保护其免受酶降解。这些载体的理化性质，包括脂质组成、膜曲率、双层完整性和表面电荷，影响miRNA稳定性、生物分布和细胞摄取，从而延长其在细胞外的功能寿命。
这些生物分子组装体在膳食和跨界miRNAs的背景下尤为重要。植物、动物和微生物来源的miRNAs同样可被封装在细胞外囊泡内或通过蛋白质和脂质复合物的结合而稳定，增强其对热处理、pH波动和胃肠道消化的抵抗力。这种结构保护已被提出作为外源miRNAs在食品加工和消化过程中存活的前提条件，尽管肠道吸收效率及其在跨界调控中的生理相关性仍是持续研究的主题。
总体而言，这些结构和动态特征控制miRNA丰度、细胞内运输、持久性和靶标特异性。结构生物学的最新进展，包括冷冻电子显微镜、高分辨率分子动力学模拟和单分子生物物理分析，持续揭示miRNA-蛋白质复合物如何抵抗变性、细胞外囊泡如何在恶劣环境条件下保持miRNA完整性，以及细微的结构基序如何决定选择性靶标识别。这些机制性见解为理解膳食miRNAs的稳定性提供了分子基础，并支持基于miRNA的治疗药物、生物标志物和功能性食品的合理开发。
功能性膳食miRNA活性的可能性本质上受到定量化学计量论据的约束。单个miRNAs的浓度远低于每个囊泡一个分子的水平，根据Chevillet等人对细胞外囊泡货物的绝对定量，来自各种生物来源的每个EV平均约0.00825拷贝。这种低miRNA货物代表了对可用于功能活性的miRNA数量的重要定量限制。对miRNA活性的定量分析进一步支持了这一解释，Mullokandov等人使用大规模传感器测定表明，有效抑制通常需要每个细胞约100–1000个miRNA拷贝，具体取决于靶标丰度和亲和力，Brown等人证明抑制强度与细胞内miRNA丰度成比例。AGO的可用性、靶标位点的数量、竞争性内源RNA、亚细胞定位和miRNA周转都影响miRNAs的有效性。所有这些定量发现都指向膳食miRNAs的严格化学计量瓶颈。膳食miRNAs需要能够耐受消化、穿过肠道屏障、进入细胞、分散到组织中、进入胞质溶胶、装载到AGO上，并遇到足够的靶标区域才能产生生理效应。因此，需要证明完整的膳食miRNAs能存活过这些连续的定量屏障中的每一个，才能提出跨界调控活性的主张。
当考虑膳食或外源miRNAs时，miRNA的稳定性变得尤为重要，因为来自食物的分子必须在任何系统性生物活性发生之前承受胃肠道的高度恶劣理化环境。在胃肠道消化过程中，膳食RNA暴露于低pH、蛋白水解酶、胆汁盐以及随后的胰脏和肠道核酸酶。在生理相关的胃和肠道条件下对RNA完整性、丰度和降解进行定量评估，可以提供比简单证明消化前后RNA存在更严格的消化稳定性测量。类似地，在模拟胃液和肠液中测量RNA酶半衰期，为评估RNA物种在消化过程中的持久性提供了重要的定量框架。与其将膳食miRNAs简单描述为“稳定”，其存活最好以可测量的降解动力学来表示，包括在定义的模拟消化条件下丰度随时间的变化和计算的半衰期。
植物来源miRNAs具有可能与其提议的持久性特别相关的额外结构特征。在植物中，许多小RNA经历由HEN1（HEN1甲基转移酶）催化的3′末端2′-O-甲基化。该修饰在末端核苷酸的核糖2′-羟基位置添加甲基基团，保护小RNAs免受某些形式的3′端降解和尿苷化。相比之下，典型的动物miRNAs，包括哺乳动物miRNAs，通常缺乏这种3′末端2′-O-甲基化，因此在其3′末端不具有相同的内在化学保护，尽管其他动物小RNAs，如piRNAs，可以被甲基化。从生物物理角度来看，HEN1介导的3′2′-O-甲基化因此代表了植物miRNAs内在持久性的最强分子论据之一，特别是考虑其对特定酶促降解途径的抵抗力时。然而，化学稳定性本身并不能确定膳食生物利用度或人体中的生物活性。甲基化植物miRNA在食品加工和胃肠道消化中的持久性必须与其在生理相关浓度下存活、穿过肠道屏障、进入循环、到达靶组织、装载到人类AGO蛋白上并调节内源性人类转录本的能力区分开来。
