豆类种子源丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）：从抗营养因子到靶向中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）—基质金属蛋白酶（MMP）轴的潜在肠道健康维护者

《Critical Reviews in Food Science and Nutrition》：Serine protease inhibitors in legume seeds: from antinutrients towards putative gut health maintainers

　　

豆类种子含有具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的蛋白质。传统上，丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）被视为抗营养化合物，因其能够抑制消化性丝氨酸蛋白酶。动物研究证据显示，摄入含生豆类种子和/或纯化SPI的饲粮后可出现胰腺肥大，尽管这些效应可能受到生种子整体蛋白质消化率较低等因素的偏倚。不断积累的证据表明，豆类种子来源的SPI具有抗炎活性，并可能与胃肠道（GI）健康相关。然而，这些效应背后的机制尚未被完全阐明。本综述在SPI抗营养特性及其缓解肠道炎症潜在作用的背景下，审视豆类种子来源SPI的现有知识。特别关注涉及SPI介导的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抑制的拟议机制，该抑制可能进而减少基质金属蛋白酶（MMP）激活及下游炎症通路。现有动物研究进一步提示，一部分摄入的SPI可在远端肠道保持结构完整并具有生物学活性。综上，这些证据凸显了SPI的双重生物学作用，并识别出关键知识空白，包括其肠道生物利用度及与人类胃肠道疾病的相关性。

引言
豆类种子中的丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）通过抑制丝氨酸蛋白酶调节蛋白水解活性，并参与植物对生物及非生物胁迫的防御。Kunitz胰蛋白酶抑制剂（KTI）与Bowman-Birk抑制剂（BBI）是研究最深入的两类水溶性豆类种子SPI。传统上二者因抑制消化酶及动物研究中的生长受损而被归为抗营养化合物，但后续研究表明相关效应具有物种依赖性，主要见于对胰蛋白酶抑制具有明显胰腺反应的大鼠、小鼠和雏鸡等。加工后豆类消化率改善并不能仅归因于SPI失活，还涉及蛋白质结构改变及其他抗营养因子减少。近年来研究转向SPI的潜在健康效应，尤其是其抗炎活性与炎症性肠病（IBD）等肠道疾病的关系。本综述旨在概述豆类种子SPI，批判性评价其在胃肠道（GIT）内的抗营养、抗炎和抗癌证据，讨论机制并提出作用假说；其新颖性在于整合现有证据，提出SPI经抑制促炎丝氨酸蛋白酶而减轻肠道炎症的机制框架。

BBI与KTI概述
KTI为约20 kDa、181个氨基酸的球状单链蛋白，含最多4个半胱氨酸残基和2个二硫键，通常具有单个对胰蛋白酶反应的活性位点，活性位点常涉及精氨酸和赖氨酸侧链。BBI为60–80个氨基酸、7–9 kDa的双头结构蛋白，含14个半胱氨酸和7个二硫键，具有较高热稳定性和pH稳定性；其两个抑制环可同时或分别与两个相同或不同的丝氨酸蛋白酶结合。BBI第一反应位点通常经赖氨酸-丝氨酸残基与胰蛋白酶作用，第二反应位点常经亮氨酸-丝氨酸残基与糜蛋白酶/弹性蛋白酶作用。SPI通常以标准机制与丝氨酸蛋白酶形成可逆且稳定的抑制剂-蛋白酶复合物，复合物解离常数K_assoc可达10⁸–10¹³ M^?1，使酶活性近乎完全中和。KTI与BBI通常分别以1:1和1:2摩尔比结合胰蛋白酶和糜蛋白酶，并因异构体及翻译后修饰呈现高度多态性。文献报道SPI可占种子总蛋白最高约6%，但不同豆类及研究间含量差异较大，受分析方法、参考物质、物种及生长条件影响；生物效应最终取决于抑制活性而非单纯蛋白丰度。

SPI抗营养效应的证据
SPI作为植物防御体系的一部分可抑制昆虫肠道蛋白酶。由于KTI和BBI可抑制丝氨酸蛋白酶，并可能部分抵抗热处理、酸性条件和GIT消化，其传统上被视为抗营养化合物，但目前缺乏临床相关人类消化受损证据。人类研究多为直接肠道给予纯化SPI，而非经膳食摄入豆类种子，不能复现正常膳食暴露；这些研究提示SPI可能参与胰腺酶分泌反馈调节，但未证明健康人蛋白质消化率下降、生长受损或胰腺病理。临床研究给予富含大豆BBI的浓缩物800–2,000糜蛋白酶抑制单位（CIU）未见毒性证据。动物研究中，纯化SPI可导致大鼠和鸡胰腺代谢改变及胰腺增大，但短期暴露后的胰腺增大可逆，且实验剂量常高于人类暴露。比较生与热处理大豆的研究常报告生长性能下降、蛋白质消化率降低和胰腺肥大，但生豆类中贮藏蛋白消化差及凝集素等其他成分可混杂结果。物种差异明显，胰腺质量超过约0.3%体重的啮齿类等更易出现不良反应；牛或猪胰蛋白酶较人胰蛋白酶更易在体外被抑制，而人胰腺胰蛋白酶以阳离子型为主且相对不易被抑制。体外研究还显示SPI活性降低并不必然对应蛋白质消化率改善。总体而言，现有证据不足以确认SPI是豆类种子营养品质降低的主要因素，其传统抗营养分类需结合物种、剂量、基质和人类证据重新审视。

豆类种子来源SPI缓解肠道炎症的证据
除对蛋白质消化的影响外，豆类种子来源SPI作为GI炎症和癌变潜在调节因子受到关注。支持证据主要来自体外和临床前研究，人类数据有限；少量临床研究报道BBI制剂改善溃疡性结肠炎患者结局，剂量达2,000 CIU时未见严重不良反应或毒性证据。其抗炎和抗癌机制尚未完全阐明。本综述假设SPI效应至少部分源于抑制参与基质金属蛋白酶（MMP）激活的丝氨酸蛋白酶，从而限制MMP激活并减轻与组织损伤、炎症反应和肿瘤进展相关的下游蛋白水解活性。为评价该假设，需先总结丝氨酸蛋白酶在GI炎症和疾病中的作用，再审视BBI和KTI抑制参与MMP激活及炎症信号转导的丝氨酸蛋白酶的证据。

炎症
炎症是对病原体、组织损伤和细胞损伤等有害刺激的保护性生物学反应，表现为白细胞激活与募集、炎症介质产生增加，以及中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和肠上皮细胞等分泌的蛋白酶活性升高。急性炎症通常经内源性抗炎机制消退，包括抗炎介质和 endogenous protease inhibitors 如组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）上调；持续免疫激活可导致慢性炎症，如IBD中过度蛋白酶活性促进组织损伤和稳态恢复受损。MMP是细胞外基质重塑的关键酶，以无活性前体（pro-MMP）分泌，需经中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、cathepsin G和proteinase 3等丝氨酸蛋白酶蛋白水解激活，胰蛋白酶等也可能参与。活化MMP通常受TIMP严格调控；调控失衡时MMP活性促进组织降解、持续炎症，并与IBD及结肠炎相关癌症进展相关。NE在IBD和结直肠癌受累组织中丰富，可通过激活pro-MMP、经蛋白酶激活受体（PAR）增加MMP转录，以及裂解并失活TIMP-1而放大炎症。肠上皮屏障由黏液、抗菌肽和肠道相关免疫系统等共同维持；屏障破坏、NE和MMP活性升高及MMP/TIMP平衡改变参与组织降解和屏障功能障碍。

SPI的推定抗炎与抗癌潜力
少数研究提示SPI可直接靶向MMP，并假设BBI的金属结合位点如谷氨酸和天冬氨酸残基可结合金属蛋白酶中的锌而抑制其活性；但BBI和KTI为丝氨酸蛋白酶高度特异性抑制剂，直接抑制金属蛋白酶在机制上不太可能。更合理的途径是抑制NE和cathepsin G等过度活化的丝氨酸蛋白酶，间接减少MMP激活，从而减轻上皮屏障破坏、组织重塑和肠道炎症进展。现有证据多来自体外系统和纯化蛋白，提示BBI和KTI可抑制NE等丝氨酸蛋白酶，间接干扰MMP激活并减少局部炎症。解释证据时需区分纯化SPI与粗蛋白提取物等复杂基质，纯化抑制剂研究对机制和因果关系的支持最强。

BBI对促炎丝氨酸蛋白酶的抑制
BBI是豆类种子SPI中抑制炎症相关蛋白酶研究最深入者。不同豆类来源BBI一致显示可强效抑制人NE。大豆BBI以两步结合机制抑制人NE，初始结合K_i为28 nM，随后形成高度稳定的BBI-NE复合物，K_i为2.3 nM；在20–100倍摩尔过量下可抑制NE活性95%以上。山黧豆BBI在BBI:弹性蛋白酶摩尔比2:3时可完全抑制人NE，豇豆来源推定BBI亦显示强NE抑制。BBI还可通过靶向NE或其他激活MMP的丝氨酸蛋白酶限制MMP活性。大豆BBI在80–352 μg/mL范围内剂量依赖性抑制胰蛋白酶介导的pro-MMP-1和pro-MMP-9激活；大豆BBI在200–400 μg/mL可降低胃癌细胞MMP-2和MMP-9活性，纯化tepary bean BBI可抑制小鼠MMP-9活性。NE还可上调人单核细胞MMP-2和cathepsin B表达与活性。现有体外证据支持BBI调节丝氨酸蛋白酶依赖性炎症通路，但其精确机制仍未完全明确。

KTI对促炎丝氨酸蛋白酶的抑制
相较BBI，KTI对炎症蛋白酶的研究较少。现有证据表明特定KTI也可靶向与MMP激活相关的NE通路。大豆KTI体外强效抑制NE，IC₅₀为0.3 nM，并在小鼠脂多糖诱导肺炎症模型中于50–100 μg/kg剂量下减少组织损伤且未检测到毒性；虽然该实验位于GIT外，但提示KTI可在体内保持生物学活性并调节NE驱动的病理过程。来源于Enterolobium contortisiliquum的KTI（EcTI）在20–100 nM EcTI对28 nM NE条件下抑制NE活性。Bauhinia属KTI可抑制NE（K_i,app 2.8 nM）、cathepsin G（K_i,app 1.0 nM）和胰蛋白酶（K_i,app 5 nM），并在啮齿类胃溃疡模型中分别减少大鼠66%和小鼠54%的胃黏膜损伤。EcTI在100 μM下降低人胃癌细胞膜型1-MMP表达，限制MMP-2下游激活，并减少细胞增殖、迁移和黏附。上述结果提示部分KTI具有超出胰蛋白酶抑制的较广蛋白酶抑制活性，但其与肠道炎症的相关性仍需进一步研究。

豆类种子蛋白组分对促炎丝氨酸蛋白酶的抑制
SPI抗炎潜力证据并不限于纯化形式。使用豆类种子蛋白组分等复杂食物基质虽限制将效应特异归因于BBI/KTI，但相关研究提供了补充证据。体外研究中，羽扇豆、大豆和鹰嘴豆白蛋白及球蛋白组分（100 μg/mL总蛋白）抑制MMP-9活性，白蛋白组分通常作用更强，与其较高SPI含量一致；羽扇豆和鹰嘴豆基饮料可溶性蛋白提取物（100 μg/mL）抑制MMP-9并减少结肠癌细胞迁移，但活性蛋白未被鉴定。生理相关性较强的证据来自豌豆白蛋白提取物小鼠结肠炎模型：冻干豌豆提取物（15 g/kg体重/天）及其冻干白蛋白组分（1.5 g/kg体重/天）产生相似结果，降低MMP基因表达并促进更健康肠道菌群恢复。总体而言，蛋白组分研究提示抑制促炎蛋白酶可能贡献于豆类种子摄入相关益处，但活性化合物常未明确，直接抗MMP活性不能排除其他成分贡献，机制亦未阐明，需进一步纯化和机制表征。

BBI的抗癌潜力
除对NE的直接作用及对MMP的间接作用外，BBI还被报道具有抗癌特性，尤其针对结直肠癌，而慢性肠道炎症可增加该病风险。尽管BBI和KTI均为大豆来源SPI，抗癌预防证据主要与BBI相关，抑制促炎丝氨酸蛋白酶被认为是潜在机制之一。富含大豆BBI的浓缩物可改善溃疡性结肠炎患者临床结局；与全食物或粗提物研究不同，浓缩BBI制剂可减少纤维和小分子生物活性物质等其他大豆成分的偏倚，虽不能证明因果，但提供了SPI与人GIT有益效应之间更直接的证据。纯化BBI及富含BBI浓缩物可减少啮齿类化学诱导结肠癌发生，并抑制结肠癌细胞体外增殖。这些效应被归因于GIT内SPI活性保留或干扰致癌通路，但分子靶点仍不清楚，是否涉及NE、MMP相关通路、其他蛋白酶或无关机制尚未知。BBI抗癌活性的详细讨论超出本综述的机制重点。

SPI加工与消化后的命运
豆类来源BBI和KTI的推定抗炎效应取决于其在食品加工和GI转运后保留生物学活性的程度。现有关于加工和消化对SPI活性影响的知识仍不充分，且活性未必直接反映SPI含量；多项研究提示一部分膳食SPI可存活通过GIT并在下消化道保持生物学活性。需批判性审视SPI在加工和消化过程中的稳定性及GIT内活性证据。

食品加工后SPI活性的保留
加工通常降低SPI活性，但失活程度因豆类物种、食物基质和加工条件差异较大。BBI因结构紧凑和二硫键较多，通常比KTI更耐热；BBI可耐受较宽温度范围（10–100 °C）和pH范围（1–10），而KTI一般稳定至约55 °C及pH 6–10。某些豆类食品尤其经温和热处理者仍可保留可测活性的BBI和KTI；例如100 mL豆奶估计约含9 mg KTI和5 mg BBI。然而，这些水平是否足以在人体内发挥生物学活性并调节炎症蛋白酶仍未知。

SPI的胃肠道存活与生物学活性
体外和体内研究均提示BBI和KTI因结构紧凑及广泛二硫键交联而抵抗胃酸和消化蛋白酶。动物研究中可从远端小肠回收免疫反应性或生物学活性SPI，但回收率因抑制剂种类（BBI或KTI）、分析方法（免疫学或酶学）和膳食组成差异较大。免疫化学方法主要检测SPI存在，并不必然表明抑制活性保留，因此GI转运后SPI检测应与生物学活性证据分开解释。互补分析可包括免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测完整SPI及片段、靶向蛋白质组液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定特异性肽和降解产物、放射性或稳定同位素标记追踪回收、尺寸排阻色谱或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）联合免疫检测表征复合物，以及酶学试验定量SPI活性。插管猪研究中，大豆KTI和BBI回肠回收率分别约100%和40%，而胰蛋白酶抑制剂活性（TIA）和糜蛋白酶抑制剂活性（CIA）分别下降95–98%和79–99%，可能与SPI聚集或与消化酶形成复合物有关；鹰嘴豆膳食来源BBI仅7.3%（TIA）和4.4%（CIA）到达猪末端回肠。大豆BBI与粪便微生物孵育后仍保留大部分抑制活性；口服BBI后在动物和人血清、尿液及器官中可检测到，提示部分可跨肠屏障并系统分布；大鼠灌胃纯KTI后可在GIT各段免疫化学检测到浓度升高，并在盲肠达峰，提示至少部分KTI可经GI转运到达结肠，但是否保持生物学活性尚需研究。总体而言，从加工到消化的全过程会降低但未必消除豆类SPI活性；活性BBI/KTI到达炎症肠段的 proportion 仍不确定，其抗加工、抗消化和抗微生物发酵特性支持本综述所提SPI介导机制的生物学合理性。未来需量化到达GIT不同部位的有活性膳食SPI，并确定其是否足以在体内调节丝氨酸蛋白酶活性及NE/MMP相关炎症通路；机制研究应优先使用纯化并表征的SPI，复杂基质需全面化学和生化表征以识别混杂生物活性成分，并应并列比较纯化抑制剂与相应粗提物以估计抑制剂的相对贡献。

结论与展望
本综述强调，将豆类种子来源SPI归类为抗营养化合物值得重新考虑。当前SPI不良营养效应证据基于使用生或低加工豆类种子的动物研究，结果相互矛盾，且对人类生理相关性认识有限。相反，纯化BBI和KTI在体外、体内及少量临床研究中显示潜在抗炎和/或抗癌活性。本综述提出潜在机制：SPI抑制NE及其他促炎丝氨酸蛋白酶，可能减少下游MMP依赖性组织损伤。然而，仍存在显著知识空白。证据强度因实验条件差异很大；纯化SPI研究支持抑制剂的直接生物学作用，而粗提物、蛋白浓缩物和全食物基质结果应更谨慎解释，因为观察到的效应不能明确归因于SPI。未来需使用表征良好的纯化SPI制剂证明或否定因果关系并提高研究可比性。临床前研究应使用纯化SPI，并将其纳入复杂食物基质以区分抑制剂特异性效应与其他共存种子成分；应采用相关肠道炎症动物模型评估NE活性、MMP激活、TIMP丰度、肠道屏障完整性及活性SPI向GIT下段的递送，并整合免疫学、酶学和蛋白质组学方法提供互补证据。最终需开展人类干预研究，确定摄入加工豆类种子能否提供足够活性SPI以调节炎症蛋白酶并有意义地影响肠道健康标志，包括肠道通透性、炎症生物标志物以及回肠或粪便SPI活性。总体而言，现有证据凸显SPI的双重生物学性质，支持将其重新评价为具有潜在抗炎特性的生物活性膳食成分，而非仅为抗营养因子；其消化存活、肠道生物利用度及调节人类GI疾病中蛋白酶驱动通路的能力等关键空白仍需解决。