《BioMedInformatics》：Modeling Multiple Interconnected TLR Signaling Cascades Is Needed to Recapitulate the Effector Function of Bone Marrow-Derived Macrophages
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（1）背景：对信号级联进行建模有助于解析级联内部和级联之间的结构与相互作用，并通过利用模型进行预测及设计实验来检验模型的效力，从而验证对级联的理解。本研究将多个相互连接的Toll样受体（toll-like receptor，TLR）信号级联合并进行研究，以判断
（1）背景：对信号级联进行建模有助于解析级联内部和级联之间的结构与相互作用，并通过利用模型进行预测及设计实验来检验模型的效力，从而验证对级联的理解。本研究将多个相互连接的Toll样受体（toll-like receptor，TLR）信号级联合并进行研究，以判断联合研究与单独研究是否存在显著差异。（2）方法：研究人员的方法是对先前用于构建单条TLR信号级联基于智能体模型（agent-based model，ABM）的工具进行增强，使其能够将多个独立模型组合成单个更复杂的模型。利用该工具合并了三个TLR信号模型，并将模型预测与三条级联的实验结果进行比较。实验室实验侧重两种不同读数：检测RNA表达或效应功能。（3）结果：结果显示，若以RNA为读数，模型与实验数据高度吻合；然而，为了拟合效应功能数据，研究人员不得不赋予TLR7级联更重要的角色。（4）结论：这些结果表明，建模可用于解析级联内部和级联之间的结构与相互作用，但响应模式因实验读数而异。数据还表明，对级联组合进行建模和实验对于（1）确定每条级联对特定激动剂反应的相对重要性，（2）理解级联之间的相互作用（包括协同与拮抗）至关重要。
细胞信号级联是细胞感知并响应微环境变化的核心机制。简单的级联如雌激素信号仅涉及少数组分；而Ras、丝裂原活化蛋白（MAP）激酶和Toll样受体（TLR）等复杂级联往往包含十余种组分，且多条级联相互连接，并与癌症、感染性疾病、自身免疫等多种疾病密切相关。白细胞在受到激动剂刺激时，会同时触发多条相互连接的TLR信号级联；例如巨噬细胞可通过TLR2/3/4/5应对细菌，通过TLR7/8/9应对病毒。这种多级联并行激活的特点，使得仅针对单条级联的建模难以真实反映细胞整体响应。此前研究人员已开发出构建单条TLR级联基于智能体模型（agent-based model，ABM）的工具，并在人单核细胞系THP-1中验证；但THP-1源自白血病患者，属于转化细胞。因此，本研究旨在将该工具扩展为可合并多条级联，并在非转化的小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）中检验模型能否同时预测基因表达和效应功能，尤其是抗肿瘤免疫相关功能。
研究人员将TLR4、TLR5和TLR7三条级联模型的规格输入改进后的工具，合并为一个包含共同组分和交互关系的复杂模型，并在NetLogo中执行模拟。随后，将模型预测与BMDM在单、双、三TLR激动剂处理下的实验数据进行比较。结果发现，当以RNA表达为读数时，模型预测与实验数据高度一致，且随着激动剂剂量和数量增加，NFkB（nuclear factor kappa-B，NFkB）通路激活和基因表达增强，但高剂量时出现饱和。当以效应功能（活性氧、亚硝酸盐、IL-12）为读数时，三联激动剂无论低剂量或高剂量均诱导最强响应，与基因表达模式存在明显差异。为拟合该模式，模型必须赋予TLR7级联更大的权重；简单调整TLR蛋白水平或反馈水平均无效。此外，从单条级联模型通过累积、协同或竞争模式外推双/三联模型的数据，与实验和合并模型结果均不一致，凸显了显式合并多级联的必要性。
主要关键技术方法如下。样本来源为雌性Balb/c小鼠骨髓来源的BMDM。方法包括：利用Scala编写的工具解析级联规格，自动合并TLR4/TLR5/TLR7模型并生成NetLogo可执行程序，每次模拟重复5-10次取平均；采用qRT-PCR检测基因表达；使用GeneXplain/TRANSFAC数据库预测启动子NFkB结合位点，并用NFkB抑制剂JSH-23验证NFkB依赖性；效应功能检测采用ELISA测定IL-12分泌、Greiss法测定亚硝酸盐、DCFDA流式法测定活性氧。上述方法将模型输出与实验数据迭代比较，以优化模型参数。
结果部分如下。
3.1 用于建模TLR信号级联的方法：研究人员选择TLR4（质膜）、TLR5（质膜）和TLR7（内体膜）及共同下游NFkB作为模型组分，利用改进工具合并三条级联规格，在NetLogo中生成多路径模型，输出RNA水平随时间变化的数据。
3.2 BMDM中基因表达以NFkB依赖方式发生：通过TRANSFAC数据库检索发现所有目标基因（Il1b、Il6、Cxcl9、Tnfa）启动子均有NFkB结合位点，Il-12虽未在启动子区检出但同样依赖NFkB；JSH-23抑制实验证实这些基因表达均下降，验证了以NFkB诱导RNA作为模型读数的合理性。
3.3 比较模型预测与基因表达数据：单TLR4模型和实验均呈现剂量依赖性；双TLR4/TLR5模型和实验显示双激动剂响应大于单激动剂；三TLR4/TLR5/TLR7模型和实验显示三激动剂响应最强，且高剂量时饱和。参数搜索表明，需要低水平的TLR4/TLR5受体群体并提高TLR7的相对权重，才能复现三联刺激的饱和模式。
3.4 激动剂处理的BMDM的效应功能：活性氧、亚硝酸盐和IL-12检测显示，三联激动剂处理组在低剂量和高剂量下均产生最高水平的效应功能，剂量依赖关系不如基因表达明显；只有增加TLR7级联权重后，模型输出才能拟合效应功能数据。
3.5 单TLR信号级联模型无法用于预测双/三联级联结果：研究人员用单模型预测多级联按累积、协同、竞争方式互作的数据，发现这些预测与合并模型及实验数据均不一致，说明不能通过简单加权或组合单级联模型来替代真正的多级联合并模型。
讨论部分指出，模型能够重现基因表达数据，但为了重现效应功能，必须考虑TLR7在联合激动剂响应中的主导作用；低剂量联合激动剂即可触发接近最大水平的基因表达和效应功能，提示激动剂数量比剂量更能决定效应强弱。NFkB依赖性经抑制剂验证，所选择的IL-1b、IL-6、TNF-a、IL-12和CXCL9均与促炎和抗肿瘤免疫相关；效应功能指标（活性氧、反应性氮中间体、IL-12）也直接关联巨噬细胞抗肿瘤活性。单通路模型无法适应多通路刺激，因为多种病原体和肿瘤细胞可通过不同病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）或损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）同时激活多条TLR级联。研究结论可概括为：整合多条相互连接的TLR信号级联进行建模，是重现骨髓来源巨噬细胞效应功能的必要条件；只有将级联作为一个整体研究，才能准确理解免疫细胞对复杂微环境的响应，并为疫苗设计和抗肿瘤免疫治疗提供更可靠的预测工具。
