基于重组E蛋白筛选与表征靶向蜱传脑炎病毒颗粒的ssDNA适配体及其诊断与抗病毒应用研究

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Selection and characterization of ssDNA aptamers targeting tick-borne encephalitis virus particles

　　

适配体（Aptamers）是能够以高亲和力结合靶分子的单链核酸，作为多功能的分子工具广泛应用于诊断和治疗领域。尽管已有若干针对蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）包膜蛋白（Envelope protein, E protein）的适配体被报道，但其对天然病毒颗粒的识别特性仍未得到充分表征。本研究通过系统进化配体指数富集技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX），利用一种保留了病毒颗粒主要抗原特性的重组E蛋白，鉴定出新型ssDNA适配体。四个主要候选适配体不仅表现出对TBEV E蛋白的结合活性，还能结合TBEV衍生的亚病毒颗粒（Subviral particles, SPs）。此外，这些适配体可识别TBEV感染细胞，并在模拟体内环境的血清条件下保持其结合活性。部分适配体在体外还展现出抑制TBEV感染的效果。进一步地，序列截断优化后获得的变体保留了高靶标亲和力，在24小时内表现出增强的血清稳定性，并具备中和病毒感染的能力。这些发现为靶向TBEV颗粒的ssDNA适配体提供了关键的功能验证，支持将其开发为用于TBEV及相关黄病毒（flaviviruses）诊断、抗病毒和靶向递送策略的抗体非依赖性平台。

研究背景与现存问题

蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）属于黄病毒科（Flaviviridae），可引起严重的神经系统并发症。感染后，病毒经历三个阶段的复杂致病过程：在接种部位初始复制、通过病毒血症全身扩散，以及最终侵入中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）。由于药物难以有效递送至CNS，使得TBEV感染的病灶选择性治疗尤为困难。适配体（Aptamers）是长度为10-100个核苷酸的单链核酸（DNA或RNA），能折叠成特定三维结构并以高亲和力结合靶分子，类似于抗体。相较于抗体，适配体具有易于合成、免疫原性低和易于化学修饰等优势，在生物成像和药物递送系统（Drug Delivery Systems, DDS）中日益受到重视。

然而，此前针对TBEV E蛋白的适配体研究主要集中在重组E蛋白片段或分离抗原的结合分析上，这些抗原与天然TBEV病毒颗粒抗原特性的关联尚未完全阐明。因此，这些适配体是否能结合天然TBEV颗粒在很大程度上未经验证。此外，关于抗TBEV适配体与病毒粒子相互作用的程度，以及它们是否具备适合体内给药的特性，所知甚少。这些局限性表明，验证适配体策略不仅用于体外诊断，也用于靶向递送和治疗应用所需的基础数据严重缺乏。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员利用一种保留了天然TBEV颗粒主要抗原表位的重组E蛋白（E-Fc），通过SELEX技术筛选出新型ssDNA适配体，并对其生化和功能特性进行了表征。研究评估了这些适配体对TBEV颗粒、抗原和感染细胞的结合亲和力与特异性，检验了它们在适配体体外诊断系统中的适用性。同时，为获取TBEV特异性ssDNA适配体体内应用的初步信息，研究人员检测了其生物稳定性、识别TBEV感染细胞的能力以及抑制病毒感染的能力，并通过序列截断分析优化了适配体长度。

研究得出结论：成功鉴定了四种主要候选适配体（aptE-Fc/3-1至3-4），其中aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2对两种TBEV株系的亚病毒颗粒（SPs）表现出高结合亲和力，其表观解离常数（K_{d, app}）分别为6.4 nM和6.1 nM，与先前报道的适配体相当。所有适配体均优先结合TBEV E蛋白而非抗原相似的日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）E蛋白。截断后的变体aptE-Fc/3-1_37和aptE-Fc/3-2_32保留了结合能力，其中aptE-Fc/3-2_32在血清中24小时后仍维持结合活性。这些适配体能选择性结合TBEV感染细胞。部分适配体在体外表现出对TBEV感染的抑制作用，aptE-Fc/3-2及其截断变体aptE-Fc/3-2_32显示出浓度依赖性抗病毒效果，IC₅₀分别为25.0 μM和9.1 μM。这些发现为靶向TBEV颗粒的ssDNA适配体提供了关键功能验证，支持其作为抗体非依赖性平台用于TBEV及相关黄病毒的诊断、抗病毒和靶向递送策略。

主要关键技术方法

研究人员采用的关键技术方法包括：

1. 1.
   系统进化配体指数富集技术（SELEX）：使用融合了兔IgG Fc标签的重组TBEV E蛋白（E-Fc）作为靶标，经过七轮筛选获得特异性ssDNA适配体。
2. 2.
   表面等离子共振（SPR）分析：使用BiacoreX100仪器测定截断适配体与E-Fc的结合动力学参数（k_on、k_off和K_d）。
3. 3.
   核磁共振（NMR）波谱法：使用AVANCE NEO 600光谱仪在Na⁺和K⁺条件下测量aptE-Fc/3-2_32的亚氨基质子信号，以确认其G-四链体（G-quadruplex）结构形成。
4. 4.
   生物稳定性测定：将生物素标记的适配体在50%小鼠血清中于37℃孵育不同时间，通过检测其对SPs的结合活性来评估血清稳定性。
5. 5.
   改良蚀斑减少中和试验（PRNT）：将适配体与病毒混合孵育后接种BHK细胞，通过计数蚀斑数评估适配体对TBEV、JEV和Langat病毒（LGTV）感染的抑制效果。

研究结果

1. 鉴定TBEV特异性ssDNA适配体

研究人员以重组蛋白E-Fc为靶标进行SELEX筛选，经七轮筛选后从55个克隆中获得核苷酸序列。系统发育树分析将序列分为十个簇，从中选出四个最频繁的序列：aptE-Fc/3-1、aptE-Fc/3-2、aptE-Fc/3-3和aptE-Fc/3-4。结合实验显示，这四个候选适配体均能结合两种TBEV株系（Oshima 5-10和Sofjin）的SPs。aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2对Oshima 5-10 SPs的表观解离常数（K_{d, app}）分别为6.4 nM和6.1 nM，与先前报道的适配体相当，而aptE-Fc/3-3和aptE-Fc/3-4的K_{d, app}值较高。特异性分析表明，所有新适配体均优先结合TBEV E蛋白，而非抗原相似的JEV E蛋白。

2. 适配体的截断

基于二级结构预测，研究人员设计了aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2的截断变体aptE-Fc/3-1_37和aptE-Fc/3-2_32。NMR波谱证实aptE-Fc/3-2_32形成了G-四链体结构。SPR分析显示，aptE-Fc/3-1_37的缔合速率常数（k_on）高于原始适配体，导致其解离常数（K_d）更低（29.7 nM vs. 93.6 nM）。aptE-Fc/3-2_32的K_d值（14.8 nM）与原始适配体（12.5 nM）相当。

3. 适配体在诊断检测中的应用

在使用Triton X-100处理过的TBEV的检测实验中，aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2及其截断变体均显示出显著高于阴性对照的光密度（OD）值，而先前报道的适配体TBEV-2R未观察到信号增加。在建立抗体非依赖的诊断系统中，以aptE-Fc/3-1作为捕获适配体，aptE-Fc/3-1或aptE-Fc/3-2作为探针适配体，在SPs存在下均检测到荧光信号，其结果与使用抗TBEV E抗体作为捕获剂的系统一致。

4. 适配体的生物稳定性

在50%小鼠血清中孵育2小时后，aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2的残留结合活性超过70%，但24小时后活性大幅丧失。截断变体aptE-Fc/3-1_37在3小时时间点的结合活性显著低于aptE-Fc/3-1。值得注意的是，aptE-Fc/3-2_32在血清中孵育24小时后，其结合活性基本保持不变。

5. 适配体与TBEV感染细胞的结合

使用荧光标记的适配体与TBEV感染细胞反应，结果显示aptE-Fc/3-1、aptE-Fc/3-2和TBEV-2R在感染细胞中的荧光强度显著高于未感染细胞，表明这些适配体选择性地结合感染细胞。

6. 适配体对病毒感染的抑制

改良PRNT实验显示，在1 μM浓度下，aptE-Fc/3-2、aptE-Fc/3-3、aptE-Fc/3-4和TBEV-2R能降低TBEV Oshima 5-10株的蚀斑数，且aptE-Fc/3-2对同为TBEV血清复合群成员的Langat病毒（LGTV）TP21株也有显著抑制效果，但对JEV无抑制。剂量依赖性实验表明，aptE-Fc/3-2及其截断变体aptE-Fc/3-2_32均以浓度依赖性方式抑制TBEV感染，IC₅₀分别为25.0 μM和9.1 μM，且aptE-Fc/3-2_32未表现出明显细胞毒性。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究鉴定的新型适配体，特别是aptE-Fc/3-1和aptE-Fc/3-2，能识别TBEV颗粒上的抗原结构，其结合亲和力与先前报道的适配体相当。这些适配体可用于体外TBEV检测系统，包括抗体非依赖的夹心检测模式。截断变体保留了亲本适配体的功能特性，降低了合成成本，其中aptE-Fc/3-2_32还展现出更优的血清稳定性。适配体能选择性结合TBEV感染细胞，并具备体外抑制病毒感染的能力，aptE-Fc/3-2对LGTV的部分抑制效果提示其可能识别TBEV相关黄病毒中保守的抗原特征，具有广谱抗TBEV分子的潜力。尽管抗病毒效果中等，但适配体序列优化有望提高抗病毒效力。这些特性表明适配体可作为靶向分子用于病毒感染部位的定位，为开发基于适配体的TBEV靶向递送策略奠定了基础。

结论部分翻译：总之，研究人员鉴定出了能够识别TBEV颗粒、病毒抗原和感染细胞的新型ssDNA适配体。所鉴定的适配体适用于诊断检测，并具有与抗病毒和靶向应用相关的生物学特性。这些发现为未来旨在开发靶向TBEV及相关黄病毒的基于适配体的诊断、治疗及诊疗一体化策略的研究奠定了基础。