快速全血IFN-γ/IL-2释放试验：造血干细胞移植后hCMV特异性T细胞免疫纵向监测的新工具

《Journal of Virology》：Monitoring hCMV-specific T cell response in hematopoietic stem cell transplant recipients via rapid whole blood cytokine release assay

　　

摘要：人巨细胞病毒（hCMV）再激活和疾病常发生于造血干细胞移植（HSCT）受者，其原因是为预防移植物排斥所需的深度免疫抑制。尽管有明确证据表明hCMV特异性T细胞在控制hCMV复制中发挥作用，但量化hCMV特异性T细胞并未广泛用于指导移植后hCMV再激活的临床管理，主要原因是缺乏简单可靠的试验来评估hCMV特异性细胞免疫。在本研究中，研究人员开发了一种简单快速的全血干扰素γ（IFN-γ）/白细胞介素2（IL-2）细胞因子释放试验（CRA），该试验使用重叠hCMV肽定量hCMV特异性T细胞反应，并在40例健康供者和20例移植后HSCT患者的外周血中进行了验证。研究人员发现，CRA与经典IFN-γ酶联免疫斑点（ELISpot）试验相关性良好，但在检测HSCT受者hCMV特异性T细胞反应方面表现出更高敏感性。值得注意的是，CRA还捕获了与hCMV再激活相关的hCMV特异性T细胞反应动态变化。总之，这些发现表明CRA是一种简单快速的方法，可用于纵向监测HSCT受者hCMV特异性T细胞免疫，并具有指导hCMV再激活临床管理的潜力。重要性：干细胞和器官移植患者常因预防移植物排斥所需的免疫抑制而经历hCMV再激活和疾病。虽然已知hCMV特异性T细胞能有效控制hCMV复制，但由于缺乏简便可靠的试验评估hCMV特异性T细胞，移植后这些T细胞的监测在临床并未常规开展。在此，研究人员开发了一种简单快速的细胞因子释放试验，可直接在全血中定量hCMV特异性T细胞，并在健康供者和移植后HSCT患者的外周血中进行了验证。该试验与经典ELISpot试验相关性良好，并捕获了与hCMV再激活相关的hCMV特异性T细胞反应动态变化。结合其简便性，该试验非常适合移植患者hCMV特异性T细胞免疫的纵向监测。

研究背景与问题：hCMV（人巨细胞病毒，一种β疱疹病毒）在多数成人原发感染后建立终身潜伏，通常在免疫健全者中无症状，但在细胞免疫受损人群，尤其是HSCT（造血干细胞移植）受者和HIV感染者中，可引起原发感染或再激活并导致严重系统性多器官疾病。多项证据支持hCMV特异性T细胞在控制hCMV复制中的作用，HSCT受者中hCMV特异性T细胞反应与病毒控制和免于hCMV病相关。然而，移植后hCMV再激活的临床管理仍主要依赖供者/受者（D/R）hCMV特异性IgG（免疫球蛋白G）血清状态和hCMV病毒血症定量；尽管专家指南建议监测hCMV细胞介导免疫（CMI）以优化风险分层、个体化预防疗程及低水平病毒血症时安全停药，但因缺乏简单、标准化、可靠的试验，常规CMI监测未广泛实施。现有平台多需外周血单个核细胞（PBMC）分离及ELISpot或流式细胞术等专用仪器；QuantiFERON-CMV仅使用部分CD8⁺T细胞表位，遗漏全部CD4⁺T细胞反应及未覆盖表位。因此，研究人员将此前用于SARS-CoV-2等的快速全血CRA（细胞因子释放试验）改造为hCMV CRA，以覆盖hCMV UL55、UL83和UL123的重叠肽刺激全血，检测IFN-γ和IL-2，并在40例健康供者和20例HSCT受者中验证，且与IFN-γ ELISpot（酶联免疫斑点）平行比较。研究结论为CRA与经典ELISpot相关性好且在HSCT受者中更敏感，可捕获hCMV再激活相关动态变化；其意义在于为HSCT受者hCMV特异性T细胞免疫提供简单快速的纵向监测工具，并具有指导临床管理的潜力。

关键技术方法：采用全血CRA，以15-mer重叠肽池覆盖hCMV UL55、UL83和UL123刺激全血，检测上清IFN-γ和IL-2，阴性对照扣除后>10 pg/mL定义为阳性；以相同肽池行IFN-γ ELISpot，>5 SFU（斑点形成单位）/4×10⁶ PBMC定义为阳性；并用胞内细胞因子染色流式验证CD8⁺和CD4⁺T细胞反应。样本来源为新加坡招募的40例健康成人供者及20例因血液恶性肿瘤接受异基因HSCT（allo-HSCT）的成人受者，后者按hCMV风险分为预防策略组10例和抢先治疗策略组10例。

研究结果：
结果一：快速全血CRA检测健康供者外周血hCMV特异性T细胞的建立与验证。通过用UL55、UL83、UL123肽池刺激10例健康供者全血并以ELLA检测多种细胞因子，同时以相同肽池行IFN-γ ELISpot及胞内细胞因子染色流式检测，研究发现CRA分泌的IFN-γ与ELISpot的hCMV特异性IFN-γ分泌PBMC频率正相关，IL-2亦相关但量较低，Granzyme B相关性较弱，IL-10、TNF-α、IL-6、IL-1β与ELISpot频率无相关性，IL-4和IL-12p70检测不到；胞内染色证实肽池可刺激CD8⁺和CD4⁺T细胞分泌IFN-γ。结论为全血CRA可敏感、可靠地定量健康供者外周血hCMV特异性T细胞反应。

结果二：应用快速全血CRA与IFN-γ ELISpot定量HSCT受者hCMV特异性T细胞反应。通过纳入20例allo-HSCT受者（10例预防策略、10例抢先策略）并纵向采集全血，以CRA检测IFN-γ/IL-2、以IFN-γ ELISpot检测相同肽池刺激的PBMC，研究发现CRA与ELISpot结果相关，约80%的HSCT纵向样本两种方法结果一致，且CRA可额外检出约10%–15%经ELISpot会漏检的hCMV特异性阳性反应；在预防策略组中，CRA可在全血中检测hCMV特异性T细胞反应，提示循环免疫抑制药未妨碍检测。结论为CRA在HSCT受者中简单、稳健且较IFN-γ ELISpot更敏感。

结果三：快速全血CRA捕获与hCMV复制相关的hCMV特异性T细胞反应动态变化。通过纵向比较预防策略组和抢先策略组的CRA反应与hCMV病毒载量，研究发现预防策略组均为D^?/R⁺且接受抗病毒预防，其抗病毒预防期间hCMV特异性T细胞反应显著低于健康成人对照，停药后反应升高但差异未达统计学显著；有可检测hCMV病毒血症的6例中5例可检出hCMV特异性T细胞反应，无病毒血症者未检出。抢先策略组中6/10例发生持续hCMV病毒血症，所有6例CRA的IFN-γ或IL-2升高在时间上先于持续hCMV病毒血症检测；4例无或仅短暂低水平病毒血症者中，仅1例CRA可检出hCMV特异性T细胞扩增，其余3例反应逐渐下降；HSCT后30天内hCMV特异性T细胞反应在未发生持续病毒血症者中显著高于后续发生持续hCMV再激活者。两例发生hCMV病者中，CMV-011有强而持续的hCMV特异性T细胞反应，CMV-026检测不到hCMV特异性T细胞反应并随后死于hCMV肺炎。结论为CRA可敏感捕获与hCMV复制相关的hCMV特异性T细胞免疫动态变化，并可能为HSCT后再激活风险分层提供信息。

讨论总结与研究结论翻译：讨论部分指出，当前移植后hCMV再激活和疾病管理依赖D/R血清状态、系列病毒血症监测及抗病毒治疗病毒学应答评估；尽管hCMV特异性T细胞免疫与病毒控制相关，但现有试验技术复杂和后勤限制使CMI监测未广泛采用。研究人员用相同肽池对全血CRA与ELISpot进行头对头比较，发现二者在健康供者和HSCT患者中高度一致，且CRA可检出ELISpot未检出的反应；CRA无需PBMC分离、需血量少（<2 mL）、周转更快，适合纵向监测。预防策略组中抗原暴露不足时反应低，停药后及病毒复制时反应升高；抢先策略组中T细胞反应与hCMV复制在时间上相关，早期反应可能具有预测后续再激活的价值。局限包括样本量小、未能确定可指导临床管理的阳性阈值、未评估健康供者hCMV血清状态。研究结论翻译：总之，通过利用CRA的简便性和最小样本量需求，以及覆盖免疫原性hCMV抗原的重叠肽所具有的广泛且不依赖HLA（人类白细胞抗原）的刺激能力，研究人员开发了一个快速平台，可直接在HSCT患者全血中可靠检测hCMV特异性T细胞，而无需复杂的体外细胞操作。该试验适合纵向免疫监测，并提供具有临床相关性的T细胞免疫信息，可能为移植后hCMV再激活的管理提供依据。