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摘要
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种人类γ疱疹病毒，在全球90%以上的人群中建立终身持续性感染。EBV此前一直缺乏能够描绘其在B细胞和上皮细胞中生命周期、允许研究免疫应答并在宿主体内模拟持续性感染的动物模型。EBV在免疫抑制兔中
摘要
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种人类γ疱疹病毒，在全球90%以上的人群中建立终身持续性感染。EBV此前一直缺乏能够描绘其在B细胞和上皮细胞中生命周期、允许研究免疫应答并在宿主体内模拟持续性感染的动物模型。EBV在免疫抑制兔中建立强感染，导致脾脏广泛感染并出现脾肿大（splenomegaly）。EBV感染导致脾脏内滤泡形成发生改变。在感染B95-8和Akata病毒株的免疫抑制兔中，观察到相似程度的感染。在免疫正常兔中，脾脏形态与模拟感染兔相似。感染B95-8和Akata病毒的兔产生了与人类感染方式相当的针对EBNA蛋白家族的抗体应答。Akata感染在免疫抑制和免疫正常研究中均表现出更高的一致性，而B95-8感染的感染程度和免疫应答则存在差异。EBV在兔中的持续性以及EBV在淋巴细胞中的完整生命周期能否被复制，仍有待进一步研究。
论文解读
一、研究背景与问题
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种感染全球90%以上人群的人类γ疱疹病毒，与伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma）等多种B细胞和上皮细胞疾病相关。EBV在宿主体内建立终身持续性感染，通过限制其增殖性基因和潜伏基因的表达来逃避免疫检测。然而，EBV的完整生命周期一直难以在整体水平上进行建模。长期以来，永生化淋巴母细胞系被用于体外研究潜伏基因，但这种方法缺乏人类宿主体内初始B细胞原发感染的情境。器官型模型虽为上皮感染提供了见解，但仍缺乏能同时研究B细胞和上皮细胞EBV感染的体系。在动物模型方面，非人灵长类（non-human primates，NHP）研究通常使用自然感染恒河猴和棉顶狨的相关淋巴隐病毒，揭示了与人类EBV感染相似的淋巴瘤发展和T细胞应答；小鼠不完全易感EBV，因此研究多使用MHV68分析同源蛋白，而重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠虽可复制部分原发感染，但缺乏完整免疫系统对病毒感染和潜伏进展的应答情境。兔模型提供了分析EBV感染的独特机会，已有研究阐明了免疫抑制下的长期感染、与多发性硬化的相关性以及通过自然口腔和鼻腔途径感染的证据。此外，兔具有旺盛的抗体产生能力，为分析EBV疫苗候选提供了独特机会。既往所有兔研究均使用B95-8毒株，该毒株是首个被测序的EBV毒株，但携带BZLF1和BALF1基因之间约11.8 kb的缺失，该缺失移除了大部分BART miRNA簇1和全部簇2，其中部分miRNA与减弱I型干扰素应答相关，可能导致B95-8毒株在潜伏期进展方面与野生型病毒行为不同。Akata毒株经测序显示与B95-8在EBNA2和EBNA3s核苷酸水平存在差异，EBNA1因IR3重复数不同也有差异，且Akata病毒已被修饰携带细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC），允许进行病毒修饰。本研究旨在探讨B95-8和Akata毒株在免疫抑制和免疫正常模型中的感染差异，以开发改进的EBV感染动物模型。
二、研究内容与主要结论
研究人员选用新西兰白兔，将其随机分为免疫抑制试验（模拟感染n=4、B95-8 n=4、Akata n=7）和免疫正常试验（模拟感染n=4、B95-8 n=4、Akata n=7）两组。免疫抑制组通过皮下注射环孢素A（cyclosporine A，CsA）实现免疫抑制，接种2×10?病毒基因组；免疫正常组接种8×10?病毒基因组。在4周和6个月两个时间点收集脾脏、舌头和血清样本进行分析。研究得出以下主要结论：EBV在免疫抑制兔中建立强感染，Akata感染兔出现脾肿大和结节形成，而B95-8组未观察到结节；EBV感染改变脾脏滤泡形成，感染组呈现更多但更小的滤泡，且滤泡细胞占总细胞比例升高；EBER RNA在免疫抑制兔脾脏中表达，B95-8组总EBER阳性细胞数显著高于Akata组，但按总细胞数归一化后两组无显著差异；在免疫正常兔6个月时间点，EBER RNA未检出，病毒基因组低于检测限，与人类感染中循环B细胞表达EBV基因的频率极低的情况一致；感染B95-8和Akata病毒的兔产生了与人类感染方式相当的针对EBNA蛋白家族的抗体应答，Akata感染兔全部7只均显示一致的A2模式抗体应答，而B95-8感染兔中3/4显示B2模式、1/4显示B3模式。研究结果表明Akata感染在兔与兔之间的一致性更高，而B95-8感染程度和免疫应答存在变异性，提示EBV兔研究应从B95-8毒株转向更接近野生型循环EBV的Akata病毒。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：通过抗人IgG F(ab′)2诱导B95-8和Akata细胞系产生病毒，利用Benzonase消化去除未包被的病毒基因组，通过qPCR扩增BALF5基因定量病毒基因组浓度；采用免疫印迹（immunoblot）分析兔血清对EBV潜伏蛋白的抗体应答，以EBV阳性细胞核提取物（IB4）和EBV阴性细胞核提取物（Loukes）为抗原，与兔血清及人类血清对照进行杂交；通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色分析脾脏和舌头组织形态，使用ImageJ软件配合Colour Deconvolution2插件计数细胞核和滤泡；采用EBER原位杂交（in situ hybridization）检测脾脏组织中的EBER RNA表达，使用ZytoFast PLUS CISH Implementation Kit（HRP-DAB）按制造商说明进行。样本来源为新西兰白兔，分为免疫抑制（CsA处理）和免疫正常两组，分别于4周和6个月时间点收获脾脏、舌头和血清。
四、研究结果
Akata感染的CsA处理兔显示脾脏形态改变：Akata感染兔脾脏平均重量（2.98 g）大于模拟感染组（1.23 g）和B95-8组（1.08 g），虽未达统计学显著，但Akata组中观察到脾肿大、脾脏结节形成以及一只兔在试验终点前死亡的现象。结节仅在Akata组（4/6）中观察到，B95-8组（0/4）未出现。
EBV在感染后4周改变脾脏形态但不改变舌头形态：模拟感染兔脾脏切片中苏木精阳性细胞核总数高于Akata感染兔；模拟感染兔的淋巴细胞滤泡显著大于B95-8和Akata感染兔，但B95-8和Akata组的滤泡总数更多，表明感染条件下滤泡向更多、更小的方向转变；两个感染组的滤泡细胞占总细胞比例均高于模拟组。舌头组织在三组间无显著差异，口腔和鼻腔拭子中未检测到病毒基因组。
EBV EBER RNA在CsA处理的EBV感染兔脾脏中表达：B95-8和Akata感染兔的脾脏组织中均检测到EBER阳性细胞，模拟感染兔未检出。B95-8组总EBER阳性细胞数显著高于Akata组，但按总细胞数归一化后两组无显著差异。EBER在所有潜伏阶段均表达，结合此前研究在该时间点检测到EBNA2和LMP1，提示处于早期潜伏阶段（III或II型）。
感染后6个月免疫正常兔脾脏形态在各组间相似且未检测到EBER RNA：Akata组平均滤泡细胞核数和滤泡细胞比例显著高于B95-8和模拟组，但滤泡总数在三组间相似，该差异可能反映Akata组脾脏切片总细胞核数较多，转录组分析未显示两个感染组间有显著基因表达差异。EBER RNA在6个月时间点未检出，BALF5基因PCR扩增结果低于检测限，提示病毒感染可能持续存在但低于检测能力。
Akata和B95-8感染兔模拟人类对EBV感染的血清应答：人类血清呈现三种应答模式（H1、H2、H3），B95-8感染兔呈现两种模式（B2和B3），Akata感染兔仅呈现一种模式（A2）。B2和A2模式与H2模式相似，仅结合一种EBNA蛋白。Akata组7只兔全部显示一致的抗体应答，而B95-8组存在应答差异。
五、讨论与结论
本研究表明EBV在感染兔B细胞中建立了模拟人类感染的潜伏状态，为体内初始B细胞感染情境提供了重要突破。既往模型如人源化小鼠无法完全在自身B细胞中复制EBV生命周期，而多项兔研究提示兔淋巴细胞可能支持EBV感染的完整生命周期，但上皮部分的感染尚未在兔感染中得到确认。由于B95-8毒株存在约11.8 kb的缺失，包含多个与免疫逃逸和潜伏期转换相关的microRNA，使用更接近野生型循环EBV的Akata病毒可能更准确地描绘兔中的EBV感染。研究发现感染在B95-8和Akata的潜伏建立方面进展相似，但Akata感染在兔与兔之间的程度更一致，而B95-8感染存在高、低程度感染并存的现象，限制了其可重复性。Akata感染兔的抗体应答也更为一致。因此，EBV兔研究应从B95-8毒株转向Akata病毒。EBV在兔淋巴细胞中的转化潜能仍有待用Akata病毒评估，未来分析EBV毒株在兔中的永生化能力值得研究。体内研究早期永生化阶段将为EBV淋巴增殖性疾病提供丰富信息。EBV兔研究的未来前景广阔，包括与多发性硬化的关联、感染早期和晚期时间点的研究以及疫苗分析。兔上皮组织的感染仍有待阐明，但可能为EBV在上皮和B细胞间循环的生命周期提供关键见解。Akata病毒已携带BAC修饰，允许编辑病毒基因，研究修饰病毒在兔宿主中的感染能力将具有重要意义。
