《Applied Microbiology》：Breast Milk Microbiota at One Month Postpartum in Women from Arequipa, Peru, Assessed by Full-Length 16S rRNA Gene Nanopore Sequencing
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人类母乳是一种低生物量液体，其细菌群落可能有助于婴儿肠道定植；然而，秘鲁南部妇女的母乳微生物群尚未得到表征。本研究旨在利用全长16S rRNA基因纳米孔测序技术，描述秘鲁阿雷基帕妇女产后一个月（哺乳第30–33天）母乳的细菌组成和多样性。在这项横断
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人类母乳是一种低生物量液体，其细菌群落可能有助于婴儿肠道定植；然而，秘鲁南部妇女的母乳微生物群尚未得到表征。本研究旨在利用全长16S rRNA基因纳米孔测序技术，描述秘鲁阿雷基帕妇女产后一个月（哺乳第30–33天）母乳的细菌组成和多样性。在这项横断面研究中，研究人员收集了29名母亲的母乳样本，在排除8份肠杆菌目（Enterobacterales）相对丰度≥30%的样本后，对21份样本进行了分析。微生物群以芽孢杆菌门（Bacillota，原厚壁菌门；平均92%）为主，链球菌属（Streptococcus，62.9%）和葡萄球菌属（Staphylococcus，21.8%）构成微生物核心。推定物种水平分类主要对应于口腔和皮肤共生菌（缓症链球菌Streptococcus mitis、唾液链球菌Streptococcus salivarius和表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis）。α多样性较低（中位数：香农指数0.66；辛普森指数0.30；观察到的丰富度为11个属）。在主坐标分析（Bray–Curtis）中，样本根据其优势属聚类。正常体重指数母亲的观察丰富度名义上更高（p = 0.0071），而整体群落组成与母亲、产科或饮食变量无关（PERMANOVA，所有p ≥ 0.073）。本研究首次描述了阿雷基帕妇女母乳微生物群的特征，为未来研究建立了基线。
论文解读文章
一、研究背景与目的
人类母乳被公认为婴儿出生后前六个月的最佳营养来源。除营养成分和生物活性成分外，母乳还携带一个由共生菌和潜在益生菌组成的细菌群落，可能促进婴儿肠道定植。这一微生物传递在生命最初几个月尤为关键，此时婴儿肠道微生物群正在建立，接触母体微生物可能有助于免疫系统的成熟，并提供针对潜在致病微生物的保护。
关于母乳微生物群的研究已从培养依赖方法转向分子技术，主要以16S rRNA基因测序为主。然而，DNA提取方法、所分析的16S rRNA基因区域以及测序平台的差异可能导致不同研究间组成观察的变异。大多数母乳研究测序的是16S rRNA基因的短高变区，其分类分辨率取决于所分析的区域，通常限于属水平。纳米孔全长16S rRNA基因测序（V1–V9）结合为长读长设计的分类器，可提高分辨率并实现推定物种水平的分类。该方法近期才应用于母乳研究。
不同人群的研究描述了以芽孢杆菌门（Bacillota，即厚壁菌门）和变形菌门（Proteobacteria）为主的微生物群，常见属包括葡萄球菌属、链球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和乳杆菌属。尽管这些细菌类群经常被报道，但其丰度和多样性在不同人群间存在差异，可能与母体、围产期、环境和地理因素有关。尽管母乳微生物群组成研究日益增多，但大部分证据来自北美、欧洲和亚洲人群，南美洲的研究仍然有限。现有拉丁美洲数据主要来自巴西、哥伦比亚和厄瓜多尔，而秘鲁的数据仍然稀缺。秘鲁具有显著的地理多样性和人群饮食模式差异，因此其他人群描述的细菌谱不一定代表秘鲁妇女母乳微生物群的组成。特别是，秘鲁南部阿雷基帕妇女的母乳微生物群尚未被表征。因此，本研究旨在利用全长16S rRNA基因纳米孔测序，描述居住在阿雷基帕的妇女产后一个月（哺乳第30–33天）母乳的细菌组成和多样性，并探索细菌谱与选定的母体、产科和饮食变量之间的关联。
二、研究设计与主要技术方法
本研究为横断面研究，在阿雷基帕省Honorio Delgado Espinoza地区医院和初级卫生中心招募健康哺乳期妇女，年龄18–42岁，无并发症妊娠且足月分娩（≥37周）。排除患有糖尿病、高血压、妊娠并发症、早产、乳腺炎或前一个月内其他乳房感染的妇女，以及采样前30天内使用过抗生素、经常服用抗抑郁药、过量饮酒或使用非法物质的妇女。研究经秘鲁卡耶塔诺埃雷迪亚大学机构伦理审查委员会批准，所有参与者签署书面知情同意书。最终纳入21份产后一个月（哺乳第30–33天）母乳样本进行分析。
关键技术方法包括：全长16S rRNA基因扩增（V1–V9区域），使用Oxford Nanopore Technologies的Rapid Sequencing DNA 16S Barcoding Kit V14试剂盒；三代纳米孔测序在MinION Mk1D设备上进行；生物信息学分析使用VSEARCH进行嵌合体去除，以97%同一性聚类恢复丰度结构，使用EMU v3.6.2进行分类学分类，该工具结合minimap2比对和期望最大化算法，使用EMU默认参考数据库（包含rrnDB v5.6和NCBI 16S RefSeq序列）；使用decontam v1.22.0识别试剂污染物并去除被标记的属；α多样性（观察丰富度、香农指数和辛普森指数）和β多样性（基于属水平Bray–Curtis相异度的主坐标分析和PERMANOVA）分析在R v4.3.3中使用vegan包完成。
三、研究结果
3.1 参与者与样本选择
研究最初从29名符合纳入标准的阿雷基帕母亲中收集母乳样本。8份样本因肠杆菌目相对丰度≥30%且细菌谱明显异常而被排除，最终分析队列为21份样本。
3.2 序列处理与质量
每份文库随机抽平至最多50,000条读段，VSEARCH嵌合体去除占每份样本读段的0.12%至4.72%。最终测序深度范围为1,676至48,957条读段（中位数46,329）。所有样本的稀疏曲线均达到渐近线，Good覆盖率为100%，表明测序深度足以在属水平表征群落。最低深度样本（1,676条读段）在后续PCoA排序中占据中心位置，表明其降低的测序深度未使β多样性分析产生偏倚。
3.3 母乳细菌分类组成
21份样本中，细菌微生物群以芽孢杆菌门为主，平均相对丰度为92%。科水平上，链球菌科占优势（64.7%），其次是葡萄球菌科（22.5%）。其余科为次要类群：肠杆菌科（5.1%）、韦荣球菌科（3.2%）和莫拉菌科（1.7%）。属水平上，群落主要分为链球菌属（62.9%）和葡萄球菌属（21.8%），次要贡献来自埃希菌属（4.3%）、孪生球菌属（3.0%）、韦荣球菌属（3.0%）和不动杆菌属（1.6%）。物种水平上，最丰富的分类对应缓症链球菌（26.7%）、唾液链球菌（15.7%）、表皮葡萄球菌（13.0%）和链球菌属未定种（参考标识FDAARGOS_192；7.7%）。
3.4 母乳微生物群多样性与群落结构
所有样本的α多样性均较低。属水平上，香农指数中位数为0.66（范围0.29–1.75），观察丰富度中位数为每样本11个属（范围2–23），辛普森指数（1?D）中位数为0.30（范围0.11–0.78）。低辛普森值表明随机抽取的两条读段约有70%的情况属于同一属，反映丰度主要集中在链球菌属和较小程度的葡萄球菌属。基于Bray–Curtis距离的UPGMA层次聚类热图显示，样本按优势属组织成块，主要是链球菌属和葡萄球菌属，两者在几乎所有样本中共存，但通常一个占优势。核心微生物组分析确认了这一优势：属水平上仅包括链球菌属（100%样本存在）和葡萄球菌属（95%样本存在）。群落结构伴随显著个体间异质性：大多数样本（16/21，76%）以链球菌属为主，4份（19%）以葡萄球菌属为主，1份（5%）以不动杆菌属为主。
3.5 微生物多样性和组成与母体、产科和饮食变量的关联
通过Mann–Whitney检验比较各组间α多样性指数。正常BMI组的观察丰富度名义上高于超重/肥胖组（中位数：16 vs. 7个属；p = 0.0071），而香农指数或辛普森指数无显著差异。基于属水平Bray–Curtis相异度的PCoA排序（PCo1：68.9%；PCo2：18.8%）以每份样本的主要属为主，没有变量与群落组成显著相关（PERMANOVA，所有p ≥ 0.073），解释方差比例持续较低（R2 ≤ 0.13）。BMI具有最大的R2（0.25），但未达到显著性（p = 0.077）。在离散度分析（PERMDISP）中，仅BMI显示名义显著差异（p = 0.011），反映了组间内部变异的差异而非平均组成的差异。由于样本量小和部分比较组间不平衡，该结果应谨慎解释，不应视为BMI对群落组成影响的证据。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究中母乳微生物群以链球菌属（62.9%）和葡萄球菌属（21.8%）为主，构成参与者共享的微生物核心，与巴西和哥伦比亚妇女的报告一致，但本人群链球菌属丰度更高。物种水平上，优势物种对应皮肤和口腔的共生菌，其来源归因于两条途径：婴儿吮吸时口腔的逆行流动，以及母体皮肤微生物群对乳头–乳晕复合体的定植。较低丰度的埃希菌属可能反映挤奶过程中引入的细菌痕迹或肠–乳腺途径的易位，但研究设计无法区分这些来源或评估其活性。
关于多样性，观察到的低α多样性与早期哺乳期的时序动态一致，文献报道母乳微生物群丰富度和均匀度在产后第一周高于一个月时，随后在第一年内趋于稳定。
关于群落结构，样本主要根据其优势属分布，与巴西妇女的描述一致。在评估的母体、产科和饮食变量中，仅BMI与观察丰富度呈名义关联，正常体重母亲的丰富度更高，与肥胖母亲乳汁多样性较低的报告一致。但未发现任何变量与群落组成显著相关，BMI解释了最大比例的变异（R2 = 0.13）。鉴于样本量，这些分析是探索性的，不存在关联不应被解释为无效应。
研究局限性包括：样本量（n = 21）和部分比较组间不平衡限制了统计效力；全长16S rRNA测序的物种水平分辨率并非在所有细菌类群中一致，密切相关的物种如缓症链球菌群成员可能无法仅基于16S rRNA基因明确区分；物种水平分类可能受所用分类器和参考数据库影响，因此本研究的物种水平分类应视为推定性的。
研究结论：阿雷基帕妇女产后一个月的母乳微生物群以链球菌属和葡萄球菌属为主，整体群落组成与所评估的母体、产科和饮食因素无检测到的关联。物种水平分类主要对应口腔和皮肤共生菌，应视为推定性的，有待通过互补的高分辨率方法确认。本研究首次利用全长16S rRNA基因测序表征了阿雷基帕妇女的母乳微生物群，为未来的纵向和功能研究建立了基线。
