唑类耐药烟曲霉的氧化应激适应：整合转录组与线粒体呼吸活性分析

《Microbiology Spectrum》：Integrated transcriptome and mitochondrial respiratory activity analysis reveals oxidative stress adaptation in azole-resistant Aspergillus fumigatus

　　

摘要专业翻译 唑类耐药性烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是侵袭性曲霉病治疗中的重大挑战。尽管cyp51A突变已被充分表征，但与耐药性相关的全局转录响应和生理适应仍未完全阐明。研究人员采用RNA测序（RNA-seq）比较了唑类敏感菌株AF293与四种具有不同耐药机制的唑类耐药临床分离株的转录组。所有抗真菌暴露实验均使用伏立康唑（voriconazole）。通过GO和KEGG富集分析对差异表达基因（DEGs）进行了分析。进一步评估了代表性cyp51A介导耐药分离株SHJT42B中线粒体呼吸链复合物I和复合物III的活性。唑类耐药分离株在伏立康唑暴露后表现出广泛的转录重编程，其中氧化应激相关通路显著富集。氧化应激相关基因在cyp51A依赖性和cyp51A非依赖性耐药分离株中均表现出差异调控，提示唑类耐药过程中存在保守的应激反应适应机制。功能分析显示，与AF293相比，SHJT42B表现出改变的线粒体呼吸活性，其特征为复合物I和复合物III活性降低以及细胞内活性氧（ROS）水平升高。这些发现提示线粒体呼吸改变可能与唑类耐药烟曲霉的氧化应激适应相关。本研究整合转录组与功能分析，将氧化应激适应鉴定为与烟曲霉唑类耐药相关的重要生理反应。研究结果进一步提示，线粒体稳态可能代表未来联合抗真菌策略的潜在脆弱靶点，但仍需在多种耐药分离株中开展进一步研究加以验证。

论文解读

一、研究背景与科学问题

侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis, IA）是由烟曲霉（Aspergillus fumigatus）引起的最致命性真菌疾病之一。烟曲霉主要通过空气传播的分生孢子（直径约2–3 μm）在吸入后到达肺泡，在免疫功能正常个体中可被先天免疫有效清除，但在免疫功能低下患者中，分生孢子可萌发并侵入宿主组织，导致危及生命的侵袭性感染，死亡率超过50%。唑类抗真菌药物是治疗曲霉感染的一线药物，其通过结合细胞色素P450酶Cyp51，抑制14α-甾醇脱甲基化从而阻断麦角甾醇生物合成发挥抗真菌作用。然而，唑类耐药烟曲霉的出现和日益流行对曲霉病的治疗管理构成了严峻挑战。

唑类耐药可源于临床和环境污染两大来源。已知耐药机制中，cyp51A基因突变最为常见，包括与环境唑类暴露相关的串联重复突变（如TR34/L98H、TR34/L98H/S297T/F495I）和长期抗真菌治疗诱导的点突变。此外，hmg1、cyp51B、hapE及外排泵编码基因的突变或过表达也参与唑类耐药。值得注意的是，氧化应激反应对烟曲霉在不利环境中的生存至关重要，但氧化应激通路在介导唑类耐药中的潜在作用仍知之甚少。越来越多的证据表明，获得抗真菌耐药性可能伴随适应性代价，要求真菌细胞在药物压力下进行广泛的生理和代谢适应以维持生长和生存，此类适应常伴随涉及应激反应、能量代谢和线粒体功能的转录重编程。然而，线粒体功能障碍是否参与唑类耐药烟曲霉的适应过程仍 largely 未知。基于此，研究人员设计了本研究，使用四种代表不同耐药机制的临床唑类耐药分离株，旨在探究唑类耐药烟曲霉是否经历涉及氧化应激反应和线粒体功能的协调转录重编程，作为其对唑类应激适应反应的一部分。

二、研究设计与技术方法

研究人员选用参考菌株AF293（唑类敏感）和四种临床唑类耐药分离株：SHJT42B（携带cyp51A TR34/L98H突变）、H18（携带cyp51A G432A突变）、4811和4818（非cyp51A介导耐药）。所有菌株在最小培养基（MM）中37°C培养，按CLSI M38肉汤微量稀释法测定药物敏感性。RNA-seq分析中，各菌株分生孢子接种于MM液体培养基振荡培养18小时后，分别以对应浓度的伏立康唑处理2小时，未处理组作为对照。每个菌株和条件设置三个独立生物学重复。主要关键技术方法包括：RNA-seq转录组测序（Illumina NovaSeq平台，PE150双端测序）、HISAT2比对到烟曲霉参考基因组（GenBank accession: GCA_000002655.1）、StringTie定量表达水平（TPM标准化）、DESeq2鉴定差异表达基因（q值≤0.001且|FoldChange|≥2）、GO和KEGG富集分析（q<0.05）、RT-qPCR验证、DCFH-DA荧光探针法测定细胞内ROS水平、商业化试剂盒测定线粒体复合物I和复合物III活性。

三、研究结果

转录组测序与数据分析：每个样本产生约2900万至6400万双端读段，质控后比对到烟曲霉参考基因组，各样本比对率在91.96%–97.66%之间，唯一比对率在89.88%–96.09%之间，表明测序深度和比对效率良好。

差异表达基因分析：未处理条件下，AF293与SHJT42B之间鉴定出2,746个DEGs（972个上调，1,774个下调），AF293与H18之间鉴定出3,123个DEGs（1,339个上调，1,784个下调），SHJT42B与H18之间鉴定出1,578个DEGs（947个上调，631个下调）。伏立康唑处理后，AF293处理前后比较（A29_vs_A29-V）鉴定出2,970个DEGs，SHJT42B处理前后比较（SH42_vs_SH42-V）鉴定出2,489个DEGs，H18处理前后比较（H18_vs_H18-V）鉴定出2,359个DEGs。Venn图分析显示各菌株在药物处理和未处理条件下均表现出独特的转录响应特征，提示存在与唑类耐药相关的菌株特异性调控特征。

GO富集分析：各比较组的GO富集分析显示，生物学过程（BP）类别富集的GO条目数量最多（24–25个），细胞组分（CC）次之（18–22个），分子功能（MF）最少（13–16个）。与SH42_vs_SH42-V和H18_vs_H18-V相比，A29_vs_A29-V的DEGs显著富集于“生物学黏附”“多细胞生物过程”“刺激响应”等生物学过程，以及“分子转导活性”“信号转导活性”等分子功能条目，提示敏感菌株在唑类暴露后表现出增强的信号传导和响应转录特征。

KEGG通路分析：A29_vs_SH42、A29_vs_A29-V和SH42_vs_SH42-V比较组的DEGs显著富集于氧化应激相关通路，包括“过氧化物酶体”“PPAR信号通路”和“氧化磷酸化”。A29_vs_H18比较组中，29、28和27个DEGs分别富集于“酪氨酸代谢”“氨基糖和核苷酸糖代谢”“淀粉和蔗糖代谢”等代谢相关通路。H18_vs_H18-V组中，44和43个DEGs显著富集于“真核生物核糖体生物发生”和“核糖体”通路，提示唑类处理后蛋白质合成过程可能发生改变。

抗真菌耐药相关基因表达谱：热图分析显示，AFUA_6G02580、AFUA_5G13170和AFUA_2G11580在耐药分离株伏立康唑暴露后显著高表达，而野生型AF293保持较低表达水平。AFUA_6G07150和AFUA_5G13320在两个耐药分离株中均表现出持续较高的基础表达，提示其可能参与固有耐药机制。AFUA_6G09200和AFUA_2G14570表现出菌株特异性诱导模式，仅在H18中经伏立康唑处理后显著上调。

氧化应激相关基因表达：纳入非cyp51A耐药分离株4811和4818后，热图聚类显示，与AF293相比，AFUA_8G07130、AFUA_4G08580和AFUA_5G10270在耐药分离株4811中显著上调。AFUA_2G13680和AFUA_4G05915在耐药分离株中表现出中度诱导。AFUA_8G06554和AFUA_1G06100在所有组中均维持低表达水平。结果表明耐药分离株（尤其是4811）可能激活氧化应激相关通路作为其对伏立康唑暴露的适应性反应的一部分。

RT-qPCR验证：代表性DEGs的RT-qPCR验证结果与RNA-seq数据高度一致，以actin和β-tubulin作为内参基因获得相似结果，证实了转录组分析的可靠性。

SHJT42B表现出高于参考菌株AF293的ROS水平：SHJT42B的ROS产生量显著高于AF293（***P<0.001），约为AF293的1.4倍，表明耐药菌株承受显著增强的氧化负担。

SHJT42B线粒体复合物I和III活性降低：SHJT42B的复合物III活性约为0.7 nmol/min/mg蛋白，显著低于AF293的约1.7 nmol/min/mg蛋白（P<0.01）。复合物I活性方面，AF293约为15 nmol/min/mg蛋白，而SHJT42B仅约7 nmol/min/mg蛋白，下降超过50%（*P<0.001）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究首先对敏感参考菌株AF293和两个CYP51A突变耐药分离株进行全转录组分析，鉴定出氧化应激是耐药分离株中最显著改变的生物学过程之一；随后纳入两个非CYP51A突变耐药分离株，证实氧化应激相关转录变化不限于CYP51A介导的耐药。耐药分离株在伏立康唑暴露后表现出广泛的转录重编程，氧化应激相关通路显著富集。耐药相关基因表现出组成型和诱导型表达模式。值得注意的是，AFUA_2G00200（编码过氧化物酶）和AFUA_3G12270（编码谷胱甘肽酶）在SHJT42B和H18中上调但在4811和4818中下调，提示CYP51A依赖性和非依赖性耐药菌株可能依赖不同的氧化还原平衡策略。功能验证显示SHJT42B表现出ROS积累升高和线粒体复合物I/III活性降低，提示线粒体电子传递改变和氧化应激增强与耐药背景相关。研究还讨论了靶向真菌能量代谢或氧化还原稳态作为克服唑类耐药的补充策略的潜在治疗意义，并提及olorofim等新型抗真菌药物及联合用药策略的前景。

研究结论部分指出，本研究通过比较转录组分析揭示了唑类耐药烟曲霉的转录特征，表现为氧化应激相关通路的激活、代谢重编程和抗真菌压力下蛋白质合成的增强。耐药菌株对关键耐药相关基因表现出组成型和诱导型表达，提示存在与抗真菌耐受性相关的复杂调控转录网络。氧化应激通路的显著富集，尤其在耐药分离株4811中，凸显了氧化防御转录程序在唑类耐药中的潜在作用。这些发现为烟曲霉对唑类治疗的适应反应提供了新见解，并鉴定了可能作为未来抗真菌策略潜在靶点的候选基因和通路。研究同时强调，破坏氧化还原稳态——通过联合治疗或通路特异性抑制剂——可能有助于克服CYP51A介导和非CYP51A介导的耐药。研究人员承认该转录组研究具有描述性特征，不能得出明确的机制性结论，并将研究结果定位为未来功能验证的假说生成基础。