《Microbiology Spectrum》：The ESX-2 type VII secretion system is required for Mycobacterium tuberculosis survival under nutrient starvation and for reactivation from dormancy
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结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的ESX型VII分泌系统输出对细菌毒力和宿主适应至关重要的蛋白质。尽管ESX-1、ESX-3和ESX-5已被广泛表征，但ESX-2的生理作用及其对宿主-病原互作的影响在很大程度上仍未被
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的ESX型VII分泌系统输出对细菌毒力和宿主适应至关重要的蛋白质。尽管ESX-1、ESX-3和ESX-5已被广泛表征，但ESX-2的生理作用及其对宿主-病原互作的影响在很大程度上仍未被探索。实验证据表明，esx-2的表达受WhiB5调控，WhiB5是一种在体外营养饥饿条件下被诱导的转录调节因子，并且是Mtb在小鼠感染模型中再激活所必需的。本研究旨在表征ESX-2分泌系统，重点关注其在营养相关应激条件下Mtb适应/存活及毒力中的作用。esx-2基因表达谱分析显示，在营养耗竭培养基中培养Mtb或在低氧诱导的休眠状态再激活时，部分esx-2基因表达上调。与此一致，对一组Mtb ESX-2突变株（针对编码ESX-2组分的基因失活或缺失整个esx-2基因座）的表征表明，ESX-2参与Mtb在营养饥饿中的存活，并促进Mtb从休眠再激活后的生长。此外，ESX-2突变株在离体（ex vivo）模型（THP-1和A549细胞）中的胞内生长动力学及其在严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficient，SCID）小鼠中的减毒谱表明，功能性ESX-2是Mtb在宿主体内最佳复制所必需的。总体而言，这些发现确定ESX-2是Mtb在细胞内环境特有的若干营养饥饿相关应激条件下存活的调节因子，从而有助于Mtb在细胞内和体内的生长。
ESX型VII分泌系统是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）致病性的重要决定因素。Mtb基因组编码五个旁系同源的ESX分泌系统（ESX-1至ESX-5），其中ESX-1、ESX-3和ESX-5的功能已被较深入表征，而ESX-2的生理作用及其对宿主-病原互作的影响仍不清楚。既往研究提示，esx-2基因簇可能受转录调节因子WhiB5的正向调控，而WhiB5在营养饥饿条件下被诱导，并参与小鼠感染模型中Mtb的再激活。然而，ESX-2在Mtb适应营养相关应激和毒力中的具体贡献尚缺乏实验证据。因此，本研究旨在系统表征ESX-2分泌系统，明确其在Mtb营养饥饿存活、休眠再激活以及宿主内复制中的作用。
研究人员通过基因表达分析、构建多种ESX-2突变株（包括eccC2基因敲除株MtbeccC2KO、esxC基因缺失株MtbΔesxC和整个esx-2基因座缺失株MtbΔESX-2）及其互补株，结合体外营养饥饿和低氧休眠/再激活模型、THP-1巨噬细胞和A549肺泡上皮细胞感染模型以及SCID小鼠感染模型，揭示了ESX-2在Mtb营养饥饿存活和休眠再激活中的必需性，并证明其参与胞内复制和体内生长。这些发现首次将ESX-2的功能与Mtb在宿主内的适应过程明确联系起来。
在方法上，研究人员采用逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析esx-2基因表达；通过重组工程（recombineering）和cosmid互补构建并验证了突变株及回复株；采用磷酸盐缓冲液（PBS）饥饿和Wayne模型（一种逐渐耗氧的体外休眠模型）分别模拟营养缺乏和低氧休眠/再激活；使用人单核细胞白血病细胞系THP-1经PMA诱导分化的巨噬细胞和人肺腺癌细胞系A549进行胞内感染试验；使用C.B-17/Icr品系严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行体内感染；同时运用全基因组测序（WGS）检测突变株中的自发突变，并用液相色谱-串联质谱（LC-MS）和Western blot评估ESX-2对分泌组及旁系ESX系统底物分泌的影响。
esx-2基因表达在营养缺乏和低氧休眠再激活时上调。研究人员在营养缺乏条件（PBS）中检测到esxC在6小时和24小时分别上调4.6倍和4.8倍，esxD分别上调6.5倍和6.6倍，而编码ESX-2核心分泌装置组件的eccC2和eccD2无显著变化。在Wayne模型中，经40天低氧培养后，将休眠菌转移至新鲜培养基并置于最佳氧浓度下再激活，在3、6、24小时检测到esxC和esxD表达上调约2.0至2.4倍，同时mycP2在24小时上调2倍，espG2在3、6、24小时分别上调3.3、2.7和2.0倍。这提示esx-2基因在营养应激和再激活过程中被选择性诱导。
ESX-2失活突变株的构建。研究人员通过重组工程构建了eccC2基因敲除株（MtbeccC2KO）和esxC基因缺失株（MtbΔesxC），并纳入了此前构建的整个esx-2基因座缺失株（MtbΔESX-2）。通过PCR验证基因型，并通过整合携带完整esx-2基因座的cosmid I106w构建了相应的互补株。所有突变株在标准富营养培养基中的生长与野生型一致，表明ESX-2并非Mtb基础生长所必需。
ESX-2在营养饥饿条件下对Mtb存活至关重要。在PBS饥饿8天后，Mtb野生型仍保持较高活力，而MtbΔESX-2和MtbeccC2KO的存活率分别降至22.9%和31.8%，MtbΔesxC的存活率为57.2%；所有互补株的存活能力恢复至野生型水平。在7H9富营养培养基中生长无差异，说明ESX-2的功能是响应营养剥夺而非支持基础生长。
ESX-2促进低氧休眠后的复制再激活。在Wayne模型低氧适应阶段（第10天和第40天），突变株与野生型的CFU相似，表明ESX-2对低氧耐受非必需。但将第40天休眠培养物转移至有氧富营养条件后，突变株的再激活生长显著延迟：5天内MtbΔESX-2和MtbeccC2KO的CFU增加约46.4倍和43.4倍，而野生型约130倍；MtbΔesxC表型中等。互补株恢复野生型水平，提示ESX-2对于休眠后恢复生长十分重要。
ESX-2是Mtb在巨噬细胞和上皮细胞中最佳复制所必需的。在PMA分化的THP-1巨噬细胞和A549肺泡上皮细胞中，ESX-2突变株的吞噬/摄取效率与野生型无差异，但胞内复制在6天内显著减弱。例如，在THP-1细胞MOI 1:10时，MtbΔESX-2、MtbeccC2KO和MtbΔesxC的CFU比值为99.0、134.3和121.3，而野生型为334.7；在A549细胞中突变株比值约20.2至38.7，野生型为73.0。互补株在较低MOI下恢复至野生型水平，但在较高MOI下仅部分恢复。与ESX-1缺失株（CFU比值29.5）相比，ESX-2突变株的胞内缺陷相对较轻。
ESX-2突变株在SCID小鼠中表现为减毒。在C.B-17/Icr SCID小鼠静脉感染模型中，感染21天后野生型在脾和肺中约增加3 log10 CFU，而三种ESX-2突变株约增加1 log10（肺）和2 log10（脾），显示减毒表型。然而全基因组测序发现突变株群体中存在PDIM脂质基因座的自发点突变（如ppsA、mmpL7和ppsB），这些突变可能部分导致减毒，因此不能将衰减完全归因于ESX-2失活。
ESX-2失活不影响ESX-1和ESX-5底物分泌。用LC-MS比较培养滤液未鉴定出可确定的ESX-2特异性底物；Western blot分析发现，ESX-2突变株的滤液中ESX-1底物EsxA和ESX-5底物EsxN、PPE41的分泌水平与野生型一致，表明ESX-2与这些旁系系统之间没有明显的交叉影响。
在讨论中，研究人员指出esx-2基因在不同生长阶段的表达水平类似，但在特定应激条件下选择性上调，暗示该基因座的调控网络较为复杂。突变株在PBS饥饿和再激活中的表型与esxC/esxD及espG2/mycP2的诱导一致，而编码核心结构组件的基因未上调，提示不同组分的表达调控可能分属不同层面。ESX-2缺失株在营养缺乏时的存活缺陷和再激活延迟，表明该分泌系统参与Mtb在宿主内营养限制环境中的适应。在细胞模型中的结果与ESX-2对胞内复制的贡献一致，但其作用不如ESX-1重要。SCID小鼠中的减毒证据需要考虑PDIM突变的混杂因素，未来需在无突变的背景下进一步验证。进化上ESX-2在致病性分枝杆菌中保守，而部分环境适应物种中缺失，提示其可能参与宿主内特定环境（如肉芽肿）的存活。总之，这项工作对ESX-2在完全毒力的Mtb H37Rv菌株的生理学和宿主-病原互作中的作用进行了初步表征，强调其有助于细菌在营养限制条件下存活和休眠后高效重新复制。由于这些因素对最佳胞内复制至关重要，本文结果连同ESX-2在结核分枝杆菌临床分离株中的高度保守性，表明ESX-2如同其他ESX系统一样，也参与Mtb的致病生活方式。
