基于核心SNP与系统地理学分析的鼠伤寒沙门菌Infantis血清型REPJFX01株地理溯源研究

《Microbiology Spectrum》：Geographic source attribution of Salmonella serovar Infantis REPJFX01 through core SNP and phylogeographic analyses

　　

鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica）亚种enterica Infantis血清型在全球广泛分布。沙门菌Infantis REPJFX01是一种持续存在的多重耐药（multidrug-resistant, MDR）菌株，与美国散发性疾病及与鸡肉消费和国际旅行相关的疫情有关。先前的研究表明，来自美国和南美洲的REPJFX01分离株亲缘关系密切。本研究在此基础上进一步揭示，REPJFX01分离株的分布范围超出美国，且特定的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）与某些地理位置相关联。系统发育分析显示，REPJFX01分离株形成两个主要类群：（i）一个并系群，主要包含南美洲和亚洲分离株；（ii）一个单系群，主要包含美国分离株。研究人员鉴定出一个核心SNP，可用于将REPJFX01样分离株归入南美洲/亚洲类群，灵敏度达99%，特异度达96%。时间校准的系统发育分析表明，REPJFX01最近的共同祖先大约于2009年存在于秘鲁。系统地理学分析提示，REPJFX01大约在2010年通过一次单一的传播事件从南美洲扩散至美国。因此，研究结果表明，SNP鉴定可用于在病例访谈前就REPJFX01感染是在美国国内获得还是在美国境外获得提出假设。此外，识别可能导致REPJFX01传播的潜在事件，可支持制定和实施具体的公共卫生行动，例如加强对进口产品的监测。

研究背景与科学问题

非伤寒沙门菌（Non-typhoidal Salmonella, NTS）是全球腹泻病的四大主要病原体之一，在美国是第三大常见食源性疾病的病因。尽管肠炎沙门菌、纽波特沙门菌和鼠伤寒沙门菌三个血清型占主导，但Infantis血清型的重要性日益增加。Infantis血清型常与家禽尤其是鸡肉相关，近年来，携带pESI大质粒的多重耐药（multidrug-resistant, MDR）Infantis菌株在美洲、欧洲和亚洲不断出现。其中，REPJFX01菌株被美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）认定为反复出现、新兴且持续存在的菌株，已在美国引起数千例人类疾病，并与鸡肉消费和国际旅行有关。此前的一项全基因组关联研究发现，美国和南美洲的REPJFX01样分离株亲缘关系密切，形成两个有重叠的主要系统发育类群。然而，该菌株的全球分布格局、传播路径以及是否存在可用于快速地理溯源的遗传标记尚不清楚。因此，本研究旨在通过系统地理学分析，阐明REPJFX01样分离株的全球分布与传播动态，并鉴定可用于区分不同地理来源的核心单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）。

研究设计与主要结论

研究人员对892株沙门菌Infantis分离株进行了大规模系统发育和系统地理学分析，其中包括864株REPJFX01样分离株和28株非REPJFX01分离株。分析揭示了REPJFX01样分离株的全球分布，并形成了两个主要系统发育类群：南美洲/亚洲类群和美国类群。时间校准的系统发育分析表明，REPJFX01最近的共同祖先（most recent common ancestor, MRCA）大约于2009年在秘鲁出现，随后在南美洲内部扩散，并于2010年左右通过单一传播事件进入美国。此后，美国成为该菌株的一个潜在储库，并继续向多米尼加共和国、特立尼达和多巴哥以及菲律宾等国家传播。研究还发现了一个位于转酮醇酶B编码基因中的核心SNP，能以99%的灵敏度和96%的特异度区分南美洲/亚洲类群和美国类群的分离株。此外，研究人员还鉴定了25个针对特定国家或地区（如哥伦比亚、菲律宾、特立尼达和多巴哥、亚洲）的核心SNP。这些发现表明，SNP鉴定可作为快速判断美国临床病例是否为国际旅行感染的假设生成工具，从而优先调查方向。该研究强调了REPJFX01是一个全球性的公共卫生威胁，并揭示了国际贸易可能在多重耐药沙门菌全球传播中的作用。

主要关键技术方法

1. 1.
   菌株选择与数据获取：共纳入892株沙门菌Infantis分离株，包括来自美国（U.S.）和南美洲（South America, SA）的REPJFX01样分离株、CDC定义的REPJFX01临床分离株（含国际旅行史数据）、环境来源的REPJFX01样分离株以及非REPJFX01对照分离株。所有基因组组装数据均来源于美国国家生物技术信息中心病原体检测数据库（National Center for Biotechnology Information Pathogen Detection, NCBI PD）。
2. 2.
   核心SNP鉴定与系统发育树构建：使用kSNP 4.0软件，以k-mer大小为21，鉴定所有892株分离株的核心SNP，并以此构建最大简约法系统发育树。
3. 3.
   区分性SNP筛选与验证：基于系统发育树确定区分南美洲/亚洲类群与美国类群的关键节点，提取SNP位点上下游约200 bp序列，通过BLAST比对在所有分离株中进行验证，并进行灵敏度和特异度分析。
4. 4.
   系统地理学与进化分析：采用分层随机抽样选取232株代表性分离株，下载其原始测序读段，利用CFSAN SNP流程与参考基因组比对构建SNP矩阵。通过Modeltest确定最佳进化模型后，使用BEAST X软件进行时间尺度系统发育重建和地理起源推断。
5. 5.
   毒力与耐药基因筛查：基于NCBI PD元数据和BLAST比对，检测232株分离株中pESI质粒、bla_CTX-M-65、砷抗性操纵子基因（arsA, arsD, arsH）的存在情况。

研究结果

系统发育关系

基于864株REPJFX01样分离株的核心SNP构建的最大似然系统发育树显示，所有分离株形成两个主要类群：一个并系群主要包含南美洲和亚洲分离株（命名为南美洲/亚洲类群），另一个单系群主要包含美国分离株（命名为美国类群）。美国类群内还包括来自菲律宾、特立尼达和多巴哥、墨西哥及多米尼加共和国的环境分离株。绝大多数（888/892）分离株属于序列型32（sequence type 32, ST32）。所有REPJFX01样分离株均携带导致GyrA蛋白D87Y改变的突变，这可作为初步判定美国沙门菌Infantis分离株是否属于REPJFX01菌株的指标。

临床分离株与旅行史的聚类分析

在32株有国际旅行史的CDC REPJFX01人类临床分离株中，27株与环境分离株聚类在一起，且这些环境分离株的来源地与其旅行目的地一致。例如，前往多米尼加共和国的患者分离株与该国环境分离株聚为一支。这表明大多数感染很可能是在旅行期间获得的。少数未与环境分离株聚类的病例，可能是在美国境内获得感染。

全球传播的系统地理学评估

时间校准的最大分支可信度（maximum clade credibility, MCC）系统发育树表明，REPJFX01样分离株的最近共同祖先大约于2009年出现在秘鲁（地点后验概率=1），并从非REPJFX01分离株进化而来。该菌株首先在南美洲内部传播（厄瓜多尔、哥伦比亚、秘鲁、墨西哥），随后在2010-2011年间通过单一事件传入美国。之后，美国成为新的传播源，该菌株进一步扩散至多米尼加共和国（约2014年）、英国（约2015年）、加拿大（约2017年）和特立尼达和多巴哥（约2017年）。在亚洲，韩国分离株的共同祖先约在2016年出现，随后传播至沙特阿拉伯、柬埔寨和中国等地。pESI质粒存在于几乎所有分析菌株中，但四个REPJFX01相关基因（bla_CTX-M-65、arsA、arsD、arsH）的分布差异显著，且在南美洲分离株中更为普遍，提示可能存在地域特异性的选择压力。

国家和类群特异性核心SNP的鉴定

研究人员鉴定出一个位于转酮醇酶B编码基因中的核心SNP（导致N653D氨基酸改变），能够有效区分南美洲/亚洲类群和美国类群。在1630株环境分离株的验证中，该SNP将分离株正确归类到南美洲/亚洲类群的灵敏度为98.9%，特异度为95.6%。此外，还发现了25个针对特定国家或地区的核心SNP，包括特立尼达和多巴哥（10个）、菲律宾（1个）、哥伦比亚（5个）、亚洲（不含菲律宾）（4个）以及墨西哥1亚群（5个）。

讨论与结论

讨论部分指出，REPJFX01样分离株在全球范围内密切相关，但在同一地理区域内的分离株亲缘关系更近，形成了可用于地理溯源的特定亚群。系统地理学分析支持REPJFX01起源于南美洲，并在2010年左右通过单一事件传入美国的假说，这一传入可能与家禽贸易有关。美国随后成为该菌株的储库，并可能通过活鸡或鸡肉产品出口将其传播至多米尼加共和国、特立尼达和多巴哥及菲律宾等国。pESI质粒上的REPJFX01相关基因（如砷抗性基因）的分布差异，可能与不同国家在家禽饲料中使用洛克沙胂（roxarsone）的历史有关。重要的是，鉴定出的核心SNP为公共卫生部门提供了一种快速、低成本的工具，可在病例访谈前初步判断美国临床病例是本土感染还是输入性感染，从而优化调查资源分配。

研究结论：REPJFX01是一种持续存在的沙门菌菌株，在美洲广泛分布，同时也见于英国和亚洲。研究数据表明，REPJFX01（i）大约于2009年从南美洲的一个非REPJFX01菌株演化而来，（ii）首先在南美洲内部传播，随后于2010年左右传播至美国，并于2015年左右传播至亚洲。此外，美国似乎是REPJFX01的一个储库，该菌株似乎从此处继续向其他国家扩散。尽管REPJFX01样分离株总体上亲缘关系密切，但来自同一地理区域的分离株相关性更高并形成亚群，这使得系统发育学和基于SNP的预测能够判断美国人类临床分离株是否为国际获得性感染，从而为病例访谈提供依据。研究结果也证明REPJFX01是一个全球关注的菌株，并强调需要更好地理解可能导致沙门菌菌株在全球传播的进出口事件。