台湾血流分离株中高毒力肺炎克雷伯菌致病性位点的自然变异及其对毒力表型预测的局限

《mSphere》：Natural variation of hypervirulent Klebsiella pathogenicity loci among Taiwan bloodstream isolates

　　

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是医院获得性和社区获得性感染的主要原因，高毒力（hypervirulent，hvKP）菌株可在健康个体中引起严重疾病。在东南亚，糖尿病是hvKP相关化脓性肝脓肿的公认危险因素。hvKP毒力通常归因于携带编码铁载体生物合成（iuc、iro）和黏液样调节因子（rmpA、rmpA2）基因的大型毒力质粒。本研究分析了来自台湾台北的50株血流分离株，以探究伴或不伴糖尿病患者的分离株的基因组和表型特征。在糖尿病患者和肝脓肿患者中，hvKP生物标志物分别见于66%（n=33）和64%（n=32）的分离株。尽管研究人员预期hvKP分离株在该收集菌株中呈过度代表，但观察到hvKP致病性位点（pathogenicity loci）存在广泛多样性，典型ST23 hvKP谱系菌株携带不完整的KpVP-1毒力质粒。这种hvKP生物标志物多样性通常见于已获得部分毒力质粒的经典多重耐药谱系。表型试验显示，hvKP生物标志物并不能严格预测高黏液黏度、荚膜和铁载体产生或血清存活。rmpA缺失一致消除高黏液黏度，并降低小鼠肺炎模型中的毒力，而气杆菌素（aerobactin）缺失则不会。体内研究显示毒力变异不能仅由高毒力相关位点数量差异解释。这些发现强调肺炎克雷伯菌发病机制的复杂性，并表明经典生物标志物虽可有效区分hvKP与经典肺炎克雷伯菌（classical K. pneumoniae，cKP），但不足以预测hvKP菌株间毒力变异。研究人员的发现为携带不完整质粒构型的菌株毒力谱提供见解。重要性：肺炎克雷伯菌因抗菌药物耐药与高毒力趋同而对全球健康构成威胁。研究人员鉴定出毒力质粒内容物的显著多样性，包括原型hvKP谱系内不完整毒力质粒，并表明表型和体内毒力特征不能完全由单个高毒力相关位点的存在或缺失解释。尽管rmpA和iuc等经典生物标志物广泛用于区分高毒力菌株，但分析表明没有任何单一生物标志物足以可靠预测致病潜能，且毒力取决于特定位点组合和更广泛背景。这些发现凸显对hvKP发病机制理解的关键缺口，强调需要更细致的框架评估毒力。该工作对全球新发肺炎克雷伯菌菌株的临床诊断、监测和风险评估具有重要意义。

研究背景：肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是医院获得性感染和机会性感染的重要病原体，重症监护和免疫抑制患者负担尤高，也是新生儿脓毒症的重要病因。经典肺炎克雷伯菌（classical K. pneumoniae，cKP）常呈多重耐药（multidrug-resistant，MDR）并携带超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）或碳青霉烯酶；高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae，hvKP）则常引起社区获得性侵袭性感染，如肝脓肿、脑膜炎和眼内炎。hvKP毒力多与大型毒力质粒pK2044相关，其携带rmpADC、rmpA2、气杆菌素（aerobactin）合成基因iucABCD及沙门菌素（salmochelin）合成基因iroBDN等，并组织为致病性位点PAL-1（rmpA2与iucABCD）和PAL-2（rmpADC与iroBDN）。这些位点作为生物标志物可较高准确度区分hvKP与cKP，但在hvKP内部，生物标志物与毒力表型的关系尚不清晰；尤其在hvKP流行区，血流分离株中毒力质粒的自然变异及其临床意义需要评估。

研究人员开展的研究与意义：研究人员收集2017年台湾台北长庚纪念医院50株血流分离株，比较糖尿病患者与非糖尿病患者、肝脓肿与非肝脓肿患者分离株的基因组和表型差异，并对携带hvKP相关位点的代表性菌株进行长读长测序、体外毒力相关表型和小鼠肺炎模型毒力测定。研究得出，hvKP生物标志物在部分患者组中富集，但hvKP致病性位点存在广泛自然变异，典型ST23谱系亦可携带不完整KpVP-1毒力质粒；生物标志物不能严格预测高黏液黏度（hypermucoviscosity，hmv）、荚膜、铁载体、血清存活及体内毒力。rmpA/rmpADC对hmv和高毒力尤为关键，气杆菌素缺失并非必然导致高毒力丧失。该研究提示，经典生物标志物适用于区分hvKP与cKP，但不足以解释hvKP菌株间毒力差异，对临床诊断、监测和风险评估具有意义。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用2017年台湾台北长庚纪念医院50株血流分离株（糖尿病患者32例、非糖尿病患者18例；肝脓肿33例、无肝脓肿17例）。方法包括全基因组短读长与长读长测序及混合组装，利用Kleborate、Kaptive等分析序列型（sequence type，ST）、荚膜位点（capsule locus，KL）、耐药与毒力基因，并进行质粒和ICEKP1（整合性接合元件KP1，integrative and conjugative element KP1）比较、核心基因组最大似然系统发育及SNP分析；表型检测包括拉丝试验和低速离心阻力评估hmv、尿糖醛酸定量荚膜、铬天青S（Chrome-azurol S，CAS）检测铁载体、人混合血清存活和结晶紫生物膜试验；采用C57BL/6小鼠鼻内肺炎模型计算LD₅₀（半数致死剂量，50% lethal dose）。

结果：
1. 台湾肺炎克雷伯菌血流分离株的微生物学特征：全基因组测序显示50株中41株为Klebsiella pneumoniae，其余为Klebsiella variicola（n=3）、Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae（n=2）和Klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae（n=4）；菌株高度多样，共35个ST、29个KL和13种脂多糖O抗原，常见ST23（n=14）、ST65（n=2）、ST1049（n=2），常见KL1（n=15）、KL5（n=3）及O1v2（n=17）、O2v2（n=8）。该结果表明收集菌株具有显著基因组多样性，且非肺炎克雷伯菌种亦可引起血流感染。

2. 抗菌药物耐药和毒力的基因组决定因素：7株（14%）含ESBL，常见SHV-12和CTX-M-15；1株含碳青霉烯酶VIM-1及ESBL SHV-12；13株（26%）含氨基糖苷类修饰酶基因，多重耐药基因携带常见。52%（n=26）含iuc、rmpA或二者；肝脓肿患者33株中19株（57.5%）含hvKP相关位点，其余17株中7株（41%）含相关位点；糖尿病患者中19株（59%）含相关位点；仅1株“趋同”菌株DM28（ST420-KL20）同时含PAL-1、PAL-2和CTX-M-15。该结果表明耐药与毒力基因可在少数菌株中汇合。

3. 台湾血流分离株的高黏液黏度：56%分离株拉丝试验阳性；拉丝阳性株低速离心后OD₆₀₀/离心前OD₆₀₀中位数约0.4，阴性株约0.2；含hvKP致病性位点及rmpA的菌株离心阻力更高；部分rmpA阳性且拉丝阳性菌株离心阻力低（<0.4），涉及KL5、KL107等非传统hvKP荚膜型；肝脓肿与非肝脓肿菌株间无显著差异，糖尿病与非糖尿病菌株间有显著差异；糖尿病患者合并肝脓肿菌株较非糖尿病合并肝脓肿菌株离心阻力更高，且80%的糖尿病合并肝脓肿菌株含rmpA，高于非糖尿病合并肝脓肿的33.3%和糖尿病无肝脓肿的41.2%；NDM28缺乏rmpA，hmv阴性且离心阻力低（0.24）。该结果表明hmv差异主要与rmpA携带相关，并可能受其他染色体因素影响。

4. 高毒力相关致病性位点的基因组变异：26株含hvKP相关基因的菌株中9株含不完整或缺失的致病性位点；DM10和DM30含rmpADC与沙门菌素但缺气杆菌素和rmpA2；NDM28含rmpA2与气杆菌素但缺rmpADC和沙门菌素；DM1、DM3、DM5、DM7含近完整位点（气杆菌素、沙门菌素、rmpADC）但缺rmpA2；DM9和DM28含完整毒力质粒，DM28缺clb；DM9、DM28、NDM20、NDM28的rmpA2等位基因均因移码导致提前终止。该结果表明hvKP谱系内存在致病性位点的自然缺失和功能破坏。

5. 选定分离株毒力质粒结构的表征：对10株代表性菌株长读长测序和混合组装发现，8株含pK2044样毒力质粒，2株含ICEKP1，DM5同时含两者，NDM20含完整pK2044样毒力质粒的染色体整合；DM30的140 kb质粒比对pK2044并含PAL-2但不含PAL-1；NDM28的198 kb质粒含PAL-1但不含PAL-2；DM28含完整pK2044样质粒及134 kb耐药质粒（携带CTX-M-15）。该结果表明主要致病性位点可差异保留或丢失，质粒结构具有显著多样性。

6. 选定分离株的体外表型：含rmpADC菌株拉丝试验阳性且离心阻力约≥0.4；NDM28缺PAL-2，拉丝阴性且离心阻力约0.2；DM28为hmv阳性且离心阻力0.44；荚膜产量为10–23 mg/mL尿糖醛酸，未见与荚膜型或hvKP相关基因相关，hvKP5 ΔrmpA及质粒消除株荚膜低于野生型；血清存活为0%至约400%，与毒力质粒、荚膜型或O型无关联，DM9和NDM20虽含完整质粒序列（NDM20为染色体整合）却均无血清抵抗；无气杆菌素的DM10和DM30铁载体产量最低，含气杆菌素菌株间差异明显，DM1约150 mM、DM28约400 mM dipyridyl equivalent，DM7约25 mM，DM7的iucA存在E138V错义突变，邻近活性位点，可能解释其低CAS活性。该结果表明体外毒力相关表型不能被生物标志物简单预测。

7. 选定分离株的生物膜形成：结晶紫静态生物膜试验显示，在LB和M9中生物膜形成总体不依赖毒力质粒；DM9含与hvKP5相当的完整毒力质粒却在LB中几乎不形成生物膜；DM9与NDM20含相同毒力相关位点但在LB中生物膜产量差异明显，NDM20约为hvKP5的一半；DM5和NDM28在M9中差异较明显，但未显示与毒力基因相关。该结果表明生物膜形成受营养等背景影响，不能由单个质粒毒力基因解释。

8. 选定分离株的体内表型：小鼠肺炎模型LD₅₀范围为10^1.74至10^8.08；10株中9株LD₅₀<10^4.5，归为高毒力；DM1（ST260）和DM3（ST65）毒力略高于hvKP5（LD₅₀约10²）；DM5、DM7、DM9、DM30均为ST23但LD₅₀为10^2.89至10^4.14，显示同一ST内表型差异；DM30和DM10含PAL-2而不含PAL-1，LD₅₀分别为10^3.44和10^4.49；NDM28 LD₅₀为10^8.08，符合cKP表型，与其缺PAL-2一致。该结果表明rmpA等特定位点对高毒力重要，但生物标志物数量不能完全解释hvKP内部毒力差异；纳入既往cKP、趋同和hvKP菌株后，生物标志物数量与LD₅₀呈中度相关（R²=0.57）。

讨论与结论：讨论部分指出，该收集菌株高度多样，且18%（n=9）为非Klebsiella pneumoniae种；尽管ST23和pK2044相关谱系占一定比例，但pK2044骨架质粒缺失完整致病性位点较为少见。体外荚膜、血清存活和生物膜等传统毒力相关指标与致病性位点变异不完全一致，血清抵抗还受脂多糖/O抗原及染色体因素影响；体内实验显示多数菌株毒力较高，但LD₅₀差异不能由生物标志物数量或单个位点线性解释。rmpADC对hmv和高毒力具有核心作用，气杆菌素在CG23 hvKP中既非高毒力所必需也非充分条件，其需求可能具有谱系特异性。研究局限包括样本量较小、来自单一医学中心、采样日期不确切且偏向糖尿病和肝脓肿患者，结论主要基于克隆复合体23及携带pK2044版本菌株，小鼠肺炎模型可能与其他感染模型结果不同。研究结论翻译：本研究强调在hvKP流行地区Klebsiella血流分离株的基因组和表型多样性；研究结果强化了定义高毒力的复杂性，表明仅存在经典hvKP生物标志物并不能完全预测毒力潜能；相反，特定组合尤其是涉及rmpADC的组合似乎发挥关键作用，其他调控或辅助元件可能调节这些效应；值得注意的是，研究人员观察到糖尿病患者中hmv阳性分离株比例更高，且独立于肝脓肿状态；未来研究应探索糖尿病相关代谢或免疫改变如何与细菌毒力机制相互作用以影响临床结局，并需要更广泛分离株收集、功能基因组学和转录组分析以识别已知生物标志物组合之外驱动hvKP发病机制的遗传和调控元件；更深入的机制理解对于改进临床诊断、细化风险分层和开发针对性干预以应对高毒力Klebsiella威胁至关重要。