实验进化群落意外污染菌群的16个宏基因组序列资源

《Microbiology Resource Announcements》：Metagenome sequences of unintended bacterial communities from a Pseudomonas fluorescens experimental evolution study

　　我们报告了16个宏基因组序列，这些序列来自侵入以荧光假单胞菌SBW25起始的实验进化群落的意外污染菌群。在8个种群中，从中心与边缘位置取样，这些种群处于对比鲜明的均匀或不均匀葡萄糖琼脂平板环境中，低多样性细菌群落包含四个主要属：假单胞菌属、金黄杆菌属、代尔夫特菌属和莫拉氏菌属。公告利用微生物进行实验进化是检验进化假说的有力方法（1）。然而，尽管做出了最大努力，偶尔仍会有非目标环境微生物侵入。污染在实验进化中是一个未被充分报道的现实问题，然而非目标群落却很少被测序或公开保存。对这些宏基因组进行表征，可为实验室污染谱和群落组装提供经验数据，可能揭示新的微生物变异体及未来群落互作研究的候选类群。我们报告了来自8个实验种群的16个宏基因组序列——两种环境类型各4个，在平板中心和边缘取样。种群以克隆荧光假单胞菌SBW25起始，在28°C下于M9盐琼脂平板（1.5%底层琼脂，0.4%上层琼脂）上培养，以葡萄糖为唯一碳源，按“均匀”和“不均匀”（1厘米直径的中心斑块）方式分布。种群通过复制印章法（2）每日转接，持续28天。第28天的群落以甘油（40% v/v）于?80°C保存。所有重复在第21至28天之间均被非目标污染物种侵入。我们报告第28天的宏基因组序列和组装结果，作为探索污染侵入动态和空间群落结构的资源。将保存样品在5 mL Luria–Bertani（LB）培养基中培养20小时（28°C，150 rpm），以获得足够的生物量。使用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）提取DNA，并由SeqCenter（匹兹堡，宾夕法尼亚州）进行测序。样品文库按照SeqCenter标准方案制备，使用Illumina DNA Prep Kit（基于磁珠的标签化、剪切和片段筛选，目标插入片段约280 bp），搭配IDT 10-bp UDI。测序在Illumina NovaSeq X Plus平台进行（2 × 150 bp双端测序）。使用FastQC v0.11.9（3）和MultiQC v1.14（4）评估reads质量。使用fastp（5）去除低质量reads和接头。所有经过修剪的高质量双端reads使用MEGAHIT v1.2.9（6）从头组装，未进行reads亚采样。使用QUAST v5.2.0（7）评估组装指标，结果反映所有≥1,000 bp的过滤后contig。使用Kraken2 v2.1.3（8）搭配标准数据库进行分类学分析，并用Krona v2.8（9）进行可视化。为了验证物种水平鉴定，使用FastANI v0.1.3（平均核苷酸一致性[ANI]阈值≥95%）（10）将组装结果与参考基因组进行比较——荧光假单胞菌SBW25（GCF_000009225.2）、代尔夫特菌（GCF_000710165.1）、奥斯陆莫拉氏菌（GCF_001013295.1）和嗜吲哚金黄杆菌（GCF_001013415.1）。所有软件均使用默认参数，除非另有说明。测序样品产生610万至970万条reads（150 bp双端），未分箱的鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量为48.2%至60.6%，未分箱组装大小为6.7至17.6 Mbp（表1）。分类学分析推断为低多样性细菌群落（每个样品1至4个属），主要包含：假单胞菌属、金黄杆菌属、代尔夫特菌属和莫拉氏菌属（图1）。相对丰度低于1%的类群被归为“其他”。FastANI确认了荧光假单胞菌（与祖先菌株SBW25匹配；ANI为98.71%–99.97%）和代尔夫特菌（ANI为95.37%–98.36%）的物种水平身份。由于代尔夫特菌通常不能利用葡萄糖作为主要碳源（11），其存在表明其可能通过交叉取食荧光假单胞菌的副产物生长，这一互作将在未来工作中探究。相反，奥斯陆莫拉氏菌和嗜吲哚金黄杆菌在所有样品中均低于95% ANI阈值，表明这些contig可能代表先前未鉴定的物种。图1 非目标实验细菌群落的属水平群落组成。丰度谱按实验环境类型、重复种群和取样位置排列。“其他”代表所有相对丰度低于1%的类群。表1 登录号与组装统计| BioSample登录号 | 实验环境 | 样品位置 | SRA登录号 | Reads数量 | 组装大小（≥1 kb contig的Mbp） | contig数量（≥1 kb） | N50（bp） | GC（%） | 组装登录号 ||---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|| SAMN54684092 | 均匀1 | 中心 | SRR36861662 | 8,953,188 | 8.2 | 1,860 | 126,746 | 48.2 | JCDEWF000000000 || SAMN54684096 | 均匀1 | 边缘 | SRR36861652 | 8,029,160 | 11.7 | 646 | 56,944 | 53.9 | JCDEWB000000000 || SAMN54684093 | 均匀2 | 中心 | SRR36861661 | 8,621,376 | 14.9 | 2,919 | 10,594 | 55.7 | JCDEWE000000000 || SAMN54684097 | 均匀2 | 边缘 | SRR36861651 | 6,300,782 | 11.7 | 727 | 49,017 | 53.8 | JCDEWA000000000 || SAMN54684094 | 均匀3 | 中心 | SRR36861654 | 9,688,788 | 14 | 3,701 | 4,034 | 54.3 | JCDEWD000000000 || SAMN54684098 | 均匀3 | 边缘 | SRR36861650 | 6,135,264 | 11.6 | 920 | 37,331 | 53.7 | JCDEVZ000000000 || SAMN54684095 | 均匀4 | 中心 | SRR36861653 | 8,710,538 | 12.3 | 1,587 | 16,848 | 54.8 | JCDEWC000000000 || SAMN54684099 | 均匀4 | 边缘 | SRR36861649 | 6,880,240 | 11.3 | 1,202 | 30,302 | 53.2 | JCDEVY000000000 || SAMN54684100 | 不均匀1 | 中心 | SRR36861648 | 6,600,000 | 6.7 | 245 | 44,531 | 60.6 | JCDEVX000000000 || SAMN54684104 | 不均匀1 | 边缘 | SRR36861658 | 8,000,000 | 9.6 | 361 | 54,161 | 55.4 | JCDEVT000000000 || SAMN54684101 | 不均匀2 | 中心 | SRR36861647 | 7,600,000 | 11.6 | 942 | 24,842 | 50.4 | JCDEVW000000000 || SAMN54684105 | 不均匀2 | 边缘 | SRR36861657 | 8,800,000 | 17.6 | 1,755 | 27,997 | 56.2 | JCDEVS000000000 || SAMN54684102 | 不均匀3 | 中心 | SRR36861660 | 6,000,000 | 11.7 | 934 | 26,574 | 50.4 | JCDEVV000000000 || SAMN54684106 | 不均匀3 | 边缘 | SRR36861656 | 7,400,000 | 16.5 | 2,029 | 31,285 | 55.3 | JCDEVR000000000 || SAMN54684103 | 不均匀4 | 中心 | SRR36861659 | 8,600,000 | 17.3 | 1,900 | 27,875 | 55.4 | JCDEVU000000000 || SAMN54684107 | 不均匀4 | 边缘 | SRR36861655 | 8,600,000 | 16.9 | 2,145 | 29,030 | 56 | JCDEVQ000000000 |致谢本工作部分由美国国家科学基金会资助（资助号#2239197）支持S.F.B.。B.M.-H.和G.C.进行了数据分析并撰写稿件；R.M.参与数据分析；C.O.完成了所有实验工作；S.F.B.设计了实验，参与数据分析并撰写稿件。