头孢地尔对囊性纤维化患者来源的伯克霍尔德菌复合体（Bcc）与唐菖蒲伯克霍尔德菌临床分离株的体外活性研究

《Journal of Antimicrobial Chemotherapy》：In vitro activity of cefiderocol against Burkholderia cepacia complex and Burkholderia gladioli clinical isolates from cystic fibrosis patients in the United States

　　

背景：伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）和唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）是天然多重耐药的病原体，可导致囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者的慢性肺部感染以及其他易感人群的严重感染。由于对常用药物的耐药性持续出现，治疗选择仍然有限。目的：评估头孢地尔（cefiderocol）对美国CF患者来源的Bcc和B. gladioli分离株的体外活性，并将这些发现与16种其他抗菌药物的历史药敏数据进行比较。方法：共测试了150株代表多种Bcc物种和B. gladioli的临床分离株。采用铁耗竭肉汤微量稀释法（iron-depleted broth microdilution, ID-BMD）和铁耗竭琼脂稀释法（iron-depleted agar dilution, ID-AD）测定头孢地尔的最低抑菌浓度（MIC）。评估了物种特异性MIC分布，并将头孢地尔的活性与先前针对同一组分离株测试的16种其他抗菌药物的历史MIC数据进行了比较。机制研究评估了blaPenA的表达以及纯化的PenA1对头孢地尔的水解作用。结果：通过ID-BMD和ID-AD两种方法，头孢地尔的MIC50和MIC90值分别为0.06 mg/L和8 mg/L，以及0.03 mg/L和8 mg/L。对于Burkholderia cenocepacia、B. cepacia、B. gladioli和大多数“其他Bcc”物种，观察到较低的MIC90值，而对于Burkholderia multivorans和Burkholderia vietnamiensis则检测到升高的MIC90值。与16种其他药物的历史数据相比，头孢地尔显示出最低的MIC50值；它不诱导blaPen表达；并且不被纯化的PenA1水解。结论：头孢地尔对来自CF患者的Bcc和B. gladioli分离株表现出广泛的体外活性，并对关键的β-内酰胺酶介导的耐药机制表现出稳定性。

研究背景与问题

伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）包含超过20种革兰氏阴性菌物种，与唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）一样，主要影响囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者或免疫功能低下人群。头孢他啶和美罗培南等β-内酰胺类药物常作为初始治疗方案，但针对这些药物的耐药性报告日益增多。伯克霍尔德菌属（Burkholderia spp.）产生两种染色体编码的β-内酰胺酶——一种Pen样A类酶和一种C类AmpC酶——这增加了治疗难度。PenA在不同菌株间高度异质性，每种伯克霍尔德菌物种都编码具有不同底物谱的独特Pen样β-内酰胺酶。此外，PenA和AmpC受一个类似于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中AmpC/AmpR的Lys-R型转录调控因子调控。选择不诱导β-内酰胺酶产生的抗生素有助于恢复一组150株Bcc和B. gladioli菌株的药敏性，但一些最有效的组合（如哌拉西林/阿维巴坦）尚未在临床上可用。因此，对于由Bcc和B. gladioli引起的感染，存在使用临床可用药物进行额外治疗策略的未满足需求。

研究内容与结论

研究人员评估了头孢地尔（cefiderocol, FDC）——一种利用细菌铁转运系统进入细胞的铁载体头孢菌素——对150株Bcc和B. gladioli临床分离株的体外活性。结果显示，头孢地尔的MIC₅₀和MIC₉₀值分别为0.03-0.06 mg/L和8 mg/L。与16种其他抗菌药物的历史数据相比，头孢地尔显示出最左移的累积MIC分布，超过80%的分离株在≤1-2 mg/L时被抑制，优于所有对照药物。在物种水平上，B. multivorans和B. vietnamiensis表现出较高的推定耐药率。机制研究表明，头孢地尔不诱导bla_Pen表达，并且不被纯化的PenA1水解。这些发现表明，头孢地尔对Bcc和B. gladioli具有强效且广泛的体外活性，包括对多种标准治疗药物耐药的分离株，其低MIC可能归因于高效的铁载体介导摄取、对染色体β-内酰胺酶的极低诱导性以及对Pen介导水解的稳定性。

关键技术方法

1. 1.
   菌株来源与鉴定：从密歇根大学伯克霍尔德菌实验室和储存库获得150株临床分离株，涵盖14种Bcc物种和B. gladioli，均来自美国36个州68个城市的CF患者呼吸道标本。物种级鉴定采用recA序列分析。
2. 2.
   药敏试验：分别采用铁耗竭琼脂稀释法（ID-AD）和铁耗竭肉汤微量稀释法（ID-BMD）测定头孢地尔MIC。制备铁耗竭Mueller-Hinton（ID-MH）培养基，并使用Chelex^? 100去除金属离子后补充钙、镁、锌。ID-AD使用Steers^TM接种器将约10⁴ CFU接种至含倍比稀释头孢地尔的琼脂平板。ID-BMD在96孔板中进行，MIC定义为首次出现显著减少生长或无可见生长的孔。所有实验重复三次生物学重复，每次两个技术重复。
3. 3.
   一致性分析：应用CLSI和EUCAST针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）设定的头孢地尔折点，评估ID-AD与ID-BMD之间的一致性，包括分类一致性（CA）、极重大误差（VME）、重大误差（ME）和微小误差（mE）。
4. 4.
   诱导实验与免疫印迹：选取4株头孢地尔MIC>16 mg/L的临床分离株，在铁耗竭条件下以1 mg/L亚胺培南（阳性诱导对照）或1 mg/L头孢地尔处理，通过抗PenA肽抗体进行免疫印迹检测PenA/PenE表达，以RecA为内参。
5. 5.
   蛋白纯化与水解实验：纯化PenA1蛋白，将其与头孢地尔孵育，通过监测λ=259 nm处吸光度的时间依赖性变化评估头孢地尔是否被水解。

研究结果

ID-AD用于头孢地尔药敏试验的性能：通过ID-BMD和ID-AD测定了150株临床分离株和参考菌株B. multivorans ATCC 17616的头孢地尔MIC。约三分之一（36.4%）的分离株在ID-BMD中出现拖尾生长现象，采用拖尾调整终点可改善与ID-AD的一致性。分类一致性分析显示，使用CLSI折点时，ID-AD的CA为91.39%，VME为1.99%，ME为2.65%，mE为3.97%；使用EUCAST折点时，CA为88.74%，VME为5.96%，ME为5.30%。总体而言，ID-BMD（拖尾调整后）和ID-AD产生了相似的MIC分布，但ID-AD未达到CLSI或EUCAST的性能阈值。

头孢地尔对Bcc和B. gladioli分离株表现出相关抗菌活性：头孢地尔显示出强效的体外活性，两种方法的MIC₅₀为0.03-0.06 mg/L，MIC₉₀为8 mg/L。使用铜绿假单胞菌折点作为替代标准，88.74%的分离株按CLSI标准被归类为假定敏感，84.77%-85.43%按EUCAST标准被归类为假定敏感。B. multivorans和B. vietnamiensis的推定耐药率高于其他物种。与16种其他药物的历史数据比较，头孢地尔显示出最左移的累积MIC分布，超过80%的分离株在≤1-2 mg/L时被抑制。

头孢地尔不诱导bla_Pen表达，也不是PenA1的底物：在4株高MIC临床分离株中，头孢地尔在铁耗竭条件下未显著诱导bla_PenA/bla_PenE表达。纯化PenA1未能水解头孢地尔，两者孵育后的时间依赖性吸收曲线重叠。

讨论与结论总结

讨论部分指出，Bcc和B. gladioli感染的治疗仍面临重大临床挑战，这些微生物具有广泛的内在耐药性和可诱导的β-内酰胺酶表达。本研究中观察到的拖尾现象与其他关于头孢地尔药敏试验中模糊终点的报道一致，强调了标准化终点判读标准的必要性。尽管ID-AD和ID-BMD在群体水平上产生了相似的MIC分布，但在菌株水平上的差异凸显了铁载体抗生素药敏试验面临的挑战。头孢地尔的体外活性令人瞩目，其MIC₅₀和MIC₉₀值明显低于标准治疗药物，与头孢他啶/阿维巴坦和美罗培南/法硼巴坦等临床可用组合的活性最为接近。物种特异性药敏模式揭示了B. multivorans和B. vietnamiensis中存在耐药亚群。机制上，头孢地尔不诱导Pen样β-内酰胺酶表达，且不被PenA1水解，其低MIC可能源于高效的铁载体介导摄取、对染色体β-内酰胺酶的极低诱导性以及对Pen介导水解的稳定性。

研究结论：头孢地尔对来自CF患者的Bcc和B. gladioli分离株（包括对多种标准治疗药物耐药的菌株）表现出强效且广泛的体外活性。然而，本研究存在局限性，所有药敏试验均在浮游培养中进行，未评估生物膜活性，也未进行药代动力学/药效学建模或动物模型实验。此外，尚不存在针对Bcc和B. gladioli的特异性头孢地尔折点。尽管如此，这些发现支持进一步评估头孢地尔作为严重Bcc和B. gladioli感染的潜在治疗选择，尤其是在替代方案有限的情况下。未来工作将聚焦于阐明B. multivorans和B. vietnamiensis中头孢地尔MIC升高的遗传基础，同时需要临床研究来确定头孢地尔治疗在CF患者和其他易感人群中的真实世界疗效。