动态控制大肠杆菌与酿酒酵母联合体的种群，提高化学品产量

《Metabolic Engineering》：Dynamic Populations Control of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae Consortia Improves Chemical Production

　　摘要• 开发了一种用于大肠杆菌-酿酒酵母的跨物种种群控制平台。• 裂解回路通过动态控制大肠杆菌裂解来增加酵母种群。• 自主种群控制将酵母比例从7%提高到89%。• 跨物种种群控制显著提高了咖啡酸的产量。引言模式生物如大肠杆菌和酿酒酵母是生产多种化学品和天然产物最广泛使用的微生物细胞工厂（Krivoruchko & Nielsen, 2015; Lee et al., 2019）。然而，在单一微生物中重构复杂的多步生物合成途径通常会施加代谢负担。此外，不同来源酶的生理需求差异常常超出单一宿主的承受能力，从而需要将途径组分分布到多个生物体中。大肠杆菌提供快速生长动力学和优异的异源蛋白表达能力，使其成为生产各种化学品的理想平台（Pontrelli et al., 2018; Yang et al., 2021）。然而，其在执行真核特异性翻译后修饰方面的有限能力，特别是对于细胞色素P450（CYPs），限制了其在代谢工程中的应用（Chang et al., 2007）。相反，酿酒酵母提供天然的内质网膜环境，非常有利于功能性CYPs的表达（Lian et al., 2018; Lu et al., 2019）。酵母中的工程途径常常受到原核蛋白表达不良的阻碍。例如，在紫杉醇合成中，虽然大肠杆菌可以产生超过1 g/L的紫杉二烯，但随后细胞色素P450紫杉二烯5α-羟化酶（5αCYP）及其还原酶的表达导致活性可忽略不计，使得酿酒酵母成为这些酶促转化的优选宿主（Zhou et al., 2015）。在独脚金内酯的生物合成中，β-胡萝卜素顺-反异构酶需要正确组装的[2Fe-2S]铁硫簇才能发挥催化活性（Harrison et al., 2015），这一辅因子成熟过程在酵母中仍然效率极低或有缺陷（Wu et al., 2021）。为了规避这些宿主特异性表达障碍，酿酒酵母-大肠杆菌共培养已成为一种有效策略（Wu et al., 2021; Zhou et al., 2015）。尽管有许多大肠杆菌-酿酒酵母跨物种联合体在生物生产任务中协同作用的例子，但种群组成和生长动力学之间的关系仍未得到充分表征，稳定的共培养也面临挑战（West et al., 2006）。据报道，大肠杆菌（约20分钟）和酿酒酵母（约90-120分钟）之间倍增时间的差异导致大肠杆菌在共培养系统中占据优势并抑制酿酒酵母的生长（Wang et al., 2022）。相反，Zhou等人发现酿酒酵母的存在可以通过在葡萄糖上生长时积累乙醇来抑制大肠杆菌（Zhou et al., 2015）。这些矛盾的观察结果说明了酿酒酵母-大肠杆菌共培养的复杂性。因此，有必要分析两种物种在不同条件下的种群组成，并实施对联合体的动态调控，以避免微生物群落的崩溃。然而，尽管种内群落已被广泛工程化，但很少有研究尝试工程化跨物种群落结构（Zhou et al., 2015）。Zhou等人工程化大肠杆菌以代谢木糖并分泌乙酸盐作为唯一碳源以支持酿酒酵母的生长，从而避免营养竞争（Zhou et al., 2015）。这种方法提高了紫杉醇的产量。然而，这些系统缺乏对群落实时动态调控。因此，有必要建立一个稳健的框架，能够自主、实时地控制跨物种种群密度，以实现最大的化学品产量。在此，我们报告了一个动态种群控制系统，利用种间通讯系统来控制大肠杆菌的裂解，从而实现跨物种种群比例的精确、实时调控并优化生物生产。对大肠杆菌-酿酒酵母共培养的表征显示，大肠杆菌严重抑制酿酒酵母的生长，在基本培养基中酵母比例降至仅3-11%，显著影响了共培养联合体的生物合成能力。为维持种群稳定性，我们基于水杨酸介导的信号回路工程化了一个非常规的种间通讯系统，并将其与裂解模块偶联，创建了自诱导的大肠杆菌自动诱导裂解系统和酿酒酵母驱动的跨物种裂解系统。这些策略自主调控了共培养种群比例，有效挽救酵母生长。当应用于咖啡酸的分工生物合成时，这些系统显著提高了生产滴度。这项工作为跨物种合成联合体的动态控制建立了一个通用框架。章节片段大肠杆菌-酿酒酵母共培养的种群失衡损害生物合成效率在群落菌株之间分配代谢途径（分工）对于生物生产是有效的，因为它可以减少代谢负担并为酶提供有利环境（Liu et al., 2026; Yuan et al., 2020; Zhang et al., 2026）。维持种群稳定性对于分工共培养系统的成功至关重要。因此，确定共培养中每个物种的生长状态是必要的。然而，以往关于生长的研究菌株与培养条件本研究使用的菌株汇总于补充表S1。使用大肠杆菌DH5α（北京全式金生物技术有限公司，中国）和BL21（DE3）进行质粒构建和扩增。使用酿酒酵母CEN.PK102-5B进行构建。Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L NaCl，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物）和M9基本培养基（Sigma-Aldrich，M6030）用于大肠杆菌的培养，条件为37°C，200 rpm。YPD培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖）和讨论种群稳定性是微生物共培养系统中的常见问题，其中维持稳定的种间比例仍然是一个挑战，特别是在跨物种群落中（Gao et al., 2021; Song et al., 2024）。大肠杆菌-酿酒酵母联合体此前已被设计用于各种植物来源的芳香族天然产物的生物合成，如黄酮类、芪类和特化多酚类（Liu et al., 2022; Yuan et al., 2020）。然而，固有的结论总之，本研究解决了由固有生长速率差异驱动的大肠杆菌-酿酒酵母共培养中长期存在的种群失衡挑战。通过开发一种具有高动态范围和跨物种兼容性的水杨酸（Sal）介导的细胞间信号平台，我们建立了一个自主动态裂解平台，包括大肠杆菌自动诱导裂解系统和酿酒酵母驱动的跨物种裂解系统。这些系统有效挽救了酵母CRediT作者贡献声明Xinyue Liu：可视化，软件，方法学，数据管理，概念化。Huangwei Xu：验证，方法学。Haotian Zhai：写作——初稿，可视化，验证，软件，方法学，资金获取，形式分析，数据管理，概念化。Jin Hou：写作——审阅与编辑，方法学，调查，资金获取，形式分析，概念化。Kundi Zhang：方法学，形式分析。Qingsheng Qi：方法学，概念化利益冲突作者声明，他们已知无竞争经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。数据可用性声明所有讨论的数据均包含在手稿或补充信息中。其他请求请联系通讯作者。在手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明在准备本工作期间，作者使用chatGPT5.2来改进英语的语法和清晰度。使用该工具后，作者根据需要审查并编辑了内容，并对所发表文章的内容负全部责任。致谢本工作得到国家自然科学基金（32570062, 32500058）、泰山学者计划（tsqn202312061）、中国博士后科学基金（2024M761796）、青岛市博士后项目资助（QDBSH20230202109）、微生物技术国家重点实验室校内联合项目基金（SKLMTIJP-2024-01）的支持。Haotian Zhai|Xinyue Liu|Huangwei Xu|Kundi Zhang|Qingsheng Qi|Jin Hou