工程化恶臭假单胞菌在木质素相关芳香族化合物生产粘康酸过程中重构代谢通量

《Metabolic Engineering》：Engineered Pseudomonas putida reconfigures metabolic fluxes during muconate bioproduction from lignin-related aromatics

　　

工程化恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）在木质素相关芳香族化合物生产粘康酸（muconate）过程中重构代谢通量 • 确定了产粘康酸的恶臭假单胞菌CJ781菌株中被重连的葡萄糖分解代谢可产生更高的ATP可用性 • 工程化的4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoate, 4HB）至粘康酸途径诱导了葡萄糖摄取升高并伴随溢流分泌物（overflow secretions） • 在分批培养中通过过表达柠檬酸合酶（citrate synthase）减轻了丙酮酸和乙酸盐的分泌 • 通过调控儿茶酚双加氧酶（catechol dioxygenase）和原儿茶酸脱羧酶（protocatechuate decarboxylase）的表达消除了芳香族分解代谢途径的瓶颈 • 在补料分批培养中，以4-羟基苯甲酸为底物实现了36.3 g L-1的粘康酸滴度，生产率为1.1 g L-1 h-1

论文解读文章

研究背景与科学问题

粘康酸（muconate）作为一种生物优势分子（bioprivileged molecule），可直接替代己二酸（adipic acid）等石油化工产品，或转化为具有性能优势的生物产品，因而受到广泛关注。木质素相关的羟基苯甲酸类化合物，如4-羟基苯甲酸（4HB）和香草酸（vanillate），可通过AroY介导的原儿茶酸（protocatechuate, PCA）脱羧生成儿茶酚（catechol），再经儿茶酚1,2-双加氧酶（CatA）开环生成粘康酸。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440凭借其成熟的基因工程工具、广泛的分解代谢能力和高耐受性，已成为芳香族化合物生物转化的平台菌株。

研究团队前期通过删除catRBC、crc、pcaHG、pobAR等基因，并过表达vanAB、ecdBD、praI等基因，构建了产粘康酸菌株CJ781，实现了以对香豆酸（p-coumarate）为底物、补充葡萄糖条件下0.5 g L^-1 h^-1的生产率、40 g L^-1的滴度和100%的摩尔产率。然而，超过1 g L^-1 h^-1的生产率仍是经济化菌株性能的重大障碍。此外，由于CJ781中芳香族来源的碳被转向产物而非生物量，需要补充碳源和能源以支持细胞生长和维持。葡萄糖作为常用碳源，其在KT2440中的代谢已被充分研究，但产物形成对中心碳代谢和能量代谢的影响尚未被充分认识，而工程化生物合成途径往往与天然生理过程竞争，因此亟需深入研究。

研究内容与主要结论

本研究整合蛋白质组学、代谢组学和¹³C通量组学（fluxomics），系统解析了野生型KT2440和产粘康酸菌株CJ781在仅以葡萄糖或以葡萄糖加4HB为底物条件下的葡萄糖代谢重构和能量代谢特征。研究发现，在产粘康酸过程中，CJ781改变了碳和能量通量，积累了胞内代谢物，并增加了脂肪族酸分泌。这些发现指导了后续工程策略，包括降低丙酮酸和乙酸盐分泌、解除芳香族分解代谢瓶颈，最终构建出能以高于CJ781两倍以上的速率生产粘康酸的菌株。

主要关键技术方法

研究人员采用了三种核心技术手段：一是高分辨率¹³C代谢通量分析（¹³C-metabolic flux analysis），采用100% [1-¹³C]、100% [6-¹³C]和50:50% [U-¹³C₆]与未标记葡萄糖三种平行示踪方案，分析多达321个质量同位素体（mass isotopomers）；二是基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组学分析，对两菌株两种培养条件进行主成分分析验证生物学重复一致性；三是代谢组学分析，结合胞外代谢物分泌速率测定和胞内代谢物池定量。此外，还通过基因敲除和过表达策略（如gltA过表达、catA2和aroY表达调控）进行菌株工程改造，并在1-L补料分批生物反应器中验证工程菌株性能。

研究结果

产粘康酸过程中葡萄糖摄取和2-酮葡糖酸氧化速率增加

在葡萄糖加4HB培养条件下，CJ781的4HB摄取速率与KT2440相近，但葡萄糖摄取速率较KT2440增加了64%，同时葡萄糖通透酶OprB-I丰度增加2.2倍。CJ781的葡萄糖摄取速率（以碳当量计，72.9 ± 12.5 mM碳 g_CDW^-1 h^-1）与KT2440的葡萄糖和4HB总碳摄取速率（69.2 ± 11.3 mM碳 g_CDW^-1 h^-1）相当，提示CJ781通过代谢再平衡来弥补4HB无法同化为生物量的缺失。在产粘康酸条件下，CJ781分泌2-KG达葡萄糖摄取速率的14.6 ± 3.0%，葡萄糖脱氢酶Gcd丰度增加1.7倍，2-KG转运蛋白KguT增加25倍，KguK和KguD分别增加6.3倍和3.8倍，表明CJ781增加了周质氧化通量以支持快速能量产生。

粘康酸生产伴随中心碳代谢物积累和分泌

在葡萄糖加4HB培养时，CJ781胞内6PG、3-磷酸甘油酸（3PG）、乳酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和丙酮酸等代谢物池较KT2440至少增加1.8倍，其中丙酮酸胞内池增加6.1倍，外排速率增加5.7倍。柠檬酸合酶GltA在CJ781中较KT2440降低1.9倍，可能加剧了丙酮酸积累。同时，40个转运蛋白（包括有机酸外排蛋白）在CJ781中显著升高，如乳酸外排蛋白LldP增加11.6倍，乙酸盐转运蛋白ActP-I增加5.2倍。在仅以葡萄糖培养时，两菌株的有机酸分泌速率均低于葡萄糖摄取速率的1%，表明底物组成而非基因型本身是导致中心碳代谢物积累和分泌的主要原因。

CJ781在4HB存在时增加ED途径、糖异生途径和TCA循环通量

在葡萄糖加4HB培养条件下，CJ781的ED途径和TCA循环氧化侧的净通量较KT2440增加1.5倍，但TCA循环还原侧未观察到更高相对通量。KT2440将4HB来源的碳同化为琥珀酸和乙酰辅酶A，刺激了SdhABC、FumC1和Mdh等蛋白丰度升高；而CJ781不同化4HB来源的碳，SdhABC较KT2440降低1.6倍以上，Mdh降低12.2倍。此外，CJ781的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶通量方向发生逆转，将碳从PEP导向TCA循环中的草酰乙酸（OAA）而非丙酮酸，这可能是对丙酮酸积累的细胞响应。

CJ781产生明显过量的NADPH和ATP，尤其在粘康酸生产期间

模型预测在所有条件下NADPH供应均超过合成代谢需求，但在CJ781产粘康酸期间最高（19.8 ± 3.1 mmol NADPH g_CDW^-1 h^-1），主要归因于TCA循环中异柠檬酸脱氢酶通量增加约45%。在葡萄糖加4HB条件下，CJ781的模型预测ATP供应为137.3 ± 4.9 mmol ATP g_CDW^-1 h^-1，较KT2440高1.6倍，表观ATP过量增加2.5倍。实验测量证实CJ781在葡萄糖加4HB条件下总ATP浓度较KT2440增加3.1倍，ATP/ADP比值为1.52（KT2440为0.73），与模型预测一致。

过表达柠檬酸合酶gltA减轻乙酸盐和丙酮酸分泌

通过蛋白质组差异分析结合基因敲除实验，研究人员排除了乙酰辅酶A直接转化、半胱氨酸和鸟氨酸生物合成副产物等乙酸盐产生途径。过表达gltA后，胞外乙酸盐和丙酮酸浓度分别降低1.7倍和4.2倍，表明通过促进乙酰辅酶A经TCA循环利用可减轻代谢物积累和分泌。

芳香族分解代谢中间体积累可通过增加catA2和aroY表达来克服

CJ781分泌PCA和儿茶酚分别达4HB摄取速率的26.2 ± 9.0%和16.5 ± 5.9%，表明粘康酸生产途径存在显著瓶颈。在crc缺失位点过表达第二个catA2拷贝（RW133和RW134）后，儿茶酚分泌被消除，胞外PCA降低1.5倍，粘康酸生产率提高至3.0倍。进一步通过替换aroY的RBS（RW170）或添加第二个aroY拷贝（RW172），胞外PCA分别降低5.4倍和2.0倍，粘康酸生产率较RW133提高11%。

解除瓶颈的菌株在生物反应器中提高滴度和速率

在1-L补料分批生物反应器中，以10 mmol h^-1的4HB进料速率，RW133和RW170显著优于CJ781。CJ781因早期PCA和儿茶酚积累触发4HB积累，在46.5 h提前终止，粘康酸滴度较工程菌株低3倍。RW133实现最大平均粘康酸滴度46.7 ± 4.3 g L^-1，生产率为0.9 g L^-1 h^-1，保持约100%摩尔产率。将4HB进料速率提高至13 mmol h^-1后，最大滴度为36.3 ± 1.3 g L^-1，生产率提高至1.1 g L^-1 h^-1。

讨论与结论

本研究通过整合多组学分析揭示了产粘康酸菌株CJ781在葡萄糖代谢和能量代谢方面的重构特征。与以儿茶酚为底物时周质葡萄糖氧化减少不同，异源4HB至粘康酸生产触发了葡萄糖摄取增加、周质2-KG通量升高和TCA循环氧化侧通量增加，支持更高的总产量以及表观过量的NADPH和ATP。这种表型可能反映了应激相关的维持或氧化还原需求、crc缺失导致的调控改变，或工程菌株的能量效率低下。

关于乙酸盐产生途径，尽管多种可能的途径被排除，但乙酸盐在工程化P. putida中的生成机制仍需进一步研究。gltA过表达虽可减轻分批培养中的脂肪族酸分泌，但在葡萄糖限制的补料分批条件下，其收益可能有限，提示生物过程优化可作为基因工程之外的替代策略。

在菌株性能方面，通过过表达catA2和调控aroY表达，成功解除了PCA和儿茶酚的代谢瓶颈，使4HB直接进料条件下的粘康酸生产率达到1.1 g L^-1 h^-1，滴度达36 g L^-1，较原始菌株CJ781提高两倍以上。这些结果表明，代谢瓶颈的精准解除结合过程优化，可显著提升木质素相关芳香族化合物向粘康酸的生物转化效率，为木质素增值利用提供了重要的菌株和策略基础。