《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Hepatitis C viral variants bear signatures of de novo CD8+ T cell and antibody pressure after spontaneous postpartum viral suppression
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进展为慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染意味着丧失HCV特异性CD4?T细胞辅助功能、出现逃避CD8?T细胞及中和抗体（NAb）识别的病毒变异株，以及靶向剩余完整表位的CD8?T细胞功能耗竭。一旦慢性感染确立，若无治疗干预，感染通常为终身性。然而，部分慢性感染女性
进展为慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染意味着丧失HCV特异性CD4?T细胞辅助功能、出现逃避CD8?T细胞及中和抗体（NAb）识别的病毒变异株，以及靶向剩余完整表位的CD8?T细胞功能耗竭。一旦慢性感染确立，若无治疗干预，感染通常为终身性。然而，部分慢性感染女性在产后出现令人意外的病毒载量下降，这一现象已被关联至HCV特异性CD4?辅助性T细胞功能的复苏。少数女性甚至能在产后自发清除长期存在的慢性感染。为检验恢复的T细胞辅助是否在产后病毒控制的女性中增强HCV特异性CD8?T细胞或抗体应答，研究人员对HCV基因组进行了系列近全长深度测序，评估9名产后病毒载量显著下降（产后3个月下降≥1 log10，即“控制者”）及12名病毒载量相对稳定（“非控制者”）女性体内病毒MHC I类表位及抗体表位的进化情况。尽管早期产后阶段未观察到与突变的相关性，但在产后12至24个月，病毒控制与预测的CD8?T细胞及中和抗体靶向表位内的氨基酸突变强相关。控制者血浆亦表现出产后对多种HCV株中和能力的增强。综上，这些发现支持产后病毒控制由CD8?T细胞及抗体免疫压力所介导的假说。
一、研究背景与科学问题
急性丙型肝炎病毒（HCV）感染后，约20%至30%的患者在6个月内自发清除病毒，其余患者则进展为持续性终身感染，若未接受直接抗病毒药物（DAA）治疗，可导致肝硬化、终末期肝病及肝细胞癌。自发清除与协调的病毒特异性适应性免疫应答相关，其特征为持续的多功能性CD4?T细胞活性、靶向病毒基因组多种I类表位的广泛细胞毒性CD8?T细胞应答，以及有效的体液免疫，特别是靶向介导肝细胞进入的病毒包膜糖蛋白的中和抗体（NAb）。
部分发展为持续感染的患者初期能启动强大的适应性免疫应答，短暂抑制病毒复制，并可在6至12个月内表现为波动的低水平病毒血症。然而多数情况下这种控制最终丧失，导致稳定高水平病毒血症。持续感染的关键特征之一是功能性HCV特异性CD4?T细胞应答的早期崩溃，该应答对维持CD8?T细胞和B细胞效应功能至关重要。在缺乏CD4?T细胞辅助的情况下，HCV特异性CD8?T细胞功能耗竭，或因逃逸识别病毒变异株的选择而失效。同样，急性感染早期CD4?滤泡辅助性T细胞（Tfh）应答不足导致B细胞启动不佳及NAb产生延迟，进而促使包膜糖蛋白NAb表位内病毒逃逸变异株的积累。
慢性HCV感染的免疫逃逸由病毒易错的RNA依赖性RNA聚合酶（NS5B）所促进，该酶在复制过程中高频引入突变，持续产生病毒变异株，使CD8?T细胞表位及NAb靶向的包膜糖蛋白中快速出现免疫逃逸突变。在发展为慢性感染的个体中，CD8?T细胞表位逃逸突变在急性期早期即出现，此后针对逃逸表位的全新T细胞发育罕见，慢性期T细胞表位内新突变亦很少产生。相比之下，一旦NAb应答建立，其持续扩展，在整个感染过程中推动病毒持续逃逸。
慢性感染确立后，功能障碍的适应性免疫应答能否恢复仍是一个重要的未解问题。近期研究注意到经DAA治愈慢性HCV的个体中部分适应性T细胞和B细胞应答有所恢复，但DAA治愈后再感染的证据表明这些应答可能不具备保护性。在DAA介导的治愈之外，自发恢复适应性免疫应答并导致晚期病毒清除通常不会发生。
约30%至50%的慢性感染女性在分娩后出现HCV病毒复制异常下降，少数自发清除病例亦有记录。该下降在携带与急性HCV自发清除相关的有利IFNL4基因型的女性中更为常见。产后病毒血症下降亦与产生IFN-γ和IL-2的HCV特异性CD4?Th1细胞扩增相关。Th1细胞是否通过支持恢复的HCV特异性CD8?T细胞功能介导病毒控制尚不清楚。在一项聚焦两名女性的小型研究中，研究人员发现产后病毒控制与I类表位中HCV病毒逃逸突变的选择相关，提示CD8?T细胞的作用。CD4?Tfh细胞和NAb在产后病毒控制中的作用此前尚未被研究。
基于上述背景，研究人员对21名有或无产后病毒控制女性的HCV基因组进行了近全长深度测序，假设产后病毒控制女性的HCV基因组将携带CD8?T细胞和B细胞表位上新免疫压力的特征，因为病毒试图逃避重新激活的免疫应答。
二、研究内容与主要结论
研究人员对21名慢性感染女性在妊娠晚期（T3）及两个随访时间点——产后早期（EPP，产后3至6个月）和产后晚期（LPP，产后12至24个月）——的循环HCV基因组进行了深度测序。9名产后3个月病毒RNA水平较T3下降≥1 log10的受试者被指定为“控制者”，12名未达此阈值的为“非控制者”。研究聚焦于深度渗透病毒准种的突变，将T3时占准种至少80%但随访时低于20%的密码子判定为突变。结果显示，EPP时期控制者与非控制者间突变数量无显著差异，且与产后病毒控制无相关性。至LPP时期，突变数量增加，控制者中同义和非同义突变数量均显著高于非控制者，并与产后3个月的病毒控制程度显著相关。控制者中EPP至LPP期间非同义突变显著增加，提示产后病毒控制与延迟的病毒变异株选择相关。
进一步分析表明，控制者中LPP氨基酸替换更常偏离基因型共有序列方向，且更常为稀有氨基酸，这与免疫压力驱动新优势变异株选择的假说一致。通过NetMHCpan-4.1b预测算法评估MHC I类表位，约72%的LPP氨基酸替换位于预测的I类表位内，且表位内替换数量与产后病毒控制显著相关。与替换位点上下游第15位氨基酸相比，替换位点的最小%Rank_EL分数显著更低，而同义突变位点与其侧翼区域无显著差异，支持氨基酸替换确实在I类表位内被特异性选择。
在病毒蛋白分布方面，E2糖蛋白含有最高浓度的LPP氨基酸替换，其中高变区1（HVR1）为替换热点。即使排除HVR1，E2仍是替换的焦点区域。控制者中E2替换频率显著高于非控制者，并与产后病毒控制相关，且该关联在排除HVR1后依然显著。E2中和面的替换在控制者中显著增加，尤其在E2前层内的结构域B及重叠抗原区3（AR3）中。将控制者的中和面替换映射至J6株E2晶体结构及E2与CD81结合结构后，替换聚集于CD81结合重要区域。与文献记载的NAb/广谱中和抗体（bNAb）逃逸及结合残基比对发现，5名控制者中有9处LPP中和面替换发生在关键NAb结合/逃逸残基上，其中5处T3病毒序列与文献描述的NAb靶残基匹配；非控制者中仅2处替换位于关键NAb位置，且T3序列均不匹配。
为直接评估抗体压力，研究人员比较了17名控制者和15名非控制者在T3及产后3个月（3P）时血浆对表达三种HCV株（基因型1a H77、2a J6、3a S52）E1E2的HCV假颗粒（HCVpp）的中和效力。控制者血浆对H77和J6两种株的产后中和能力显著增加，对S52无显著差异，后者已知常对bNAb耐药。非控制者血浆对任何株均无显著产后中和增强。
三、主要技术方法
研究人员从美国俄亥俄州立大学物质治疗教育与预防项目产前门诊招募慢性HCV感染的孕妇，采集妊娠晚期及产后系列时间点外周血样本。采用泛基因型方案进行HCV基因组近全长PCR扩增，对扩增产物进行Illumina平台150bp双端深度测序。使用Geneious Prime进行序列分析，以T3共有序列为模板映射各时间点读段，鉴定深度渗透突变。采用NetMHCpan-4.1b预测算法结合各受试者高分辨率HLA-A、-B、-C分型数据预测MHC I类表位。通过NIH病毒病原体数据库分析资源评估氨基酸替换方向性及稀有性。将E2中和面替换映射至已发表的J6株E2晶体结构（PDB登录号7MWW和7MWX）。使用HEK293T细胞生成表达H77、J6、S52株E1E2的HCVpp，在Huh7.5细胞上进行血浆中和试验。
四、研究结果
产后病毒控制程度不同的女性中HCV早期和晚期突变。 通过深度测序分析，EPP时期控制者与非控制者间突变数量无显著差异，且与产后病毒控制无相关性。至LPP时期，控制者中同义和非同义突变数量均显著高于非控制者，并与产后3个月的病毒控制程度显著相关。控制者中EPP至LPP期间非同义突变显著增加。控制者中LPP氨基酸替换更常偏离共有序列方向且更常为稀有氨基酸，与免疫压力驱动新优势变异株选择的假说一致。
预测MHC I类表位内的病毒氨基酸替换。 约72%的LPP氨基酸替换位于预测的I类表位内，表位内替换数量与产后病毒控制显著相关。替换位点的最小%Rank_EL分数显著低于其上下游侧翼氨基酸，而同义突变位点与其侧翼区域无显著差异，表明氨基酸替换在I类表位内被特异性选择。
HCV糖蛋白E2及其中和面的氨基酸替换。 E2含有最高浓度的LPP氨基酸替换，HVR1为替换热点，但排除HVR1后E2仍是替换焦点。控制者中E2替换频率显著更高，并与产后病毒控制相关。E2中和面替换在控制者中显著增加，尤其在前层内结构域B及AR3区域。中和面替换聚集于CD81结合重要区域，且部分替换发生在文献记载的关键NAb结合/逃逸残基上。
妊娠后血浆HCV中和能力的变化。 控制者血浆对H77和J6两种HCVpp株的产后中和能力显著增加，对S52无显著差异。非控制者血浆对任何株均无显著产后中和增强。
五、讨论与结论
本研究存在一定局限性。首先，控制者LPP样本中较低的起始HCV RNA模板可能因随机奠基者效应导致次要变异株的假性过度代表，但研究未发现EPP时期控制者突变数量更高，且密码子多样性在各时间点无显著变化，亦与病毒控制程度无相关性，支持LPP检测到的突变代表病毒准种的真实变化。其次，PCR早期循环引入错误可能产生提前终止密码子或免疫表位外的广泛分布突变，但未观察到该现象。对于使用较小重叠扩增子测序的两名受试者，深度渗透突变反映的是准种变化而非引物偏倚。抗体中和研究方面，所用三种E1E2 HCVpp不能充分代表HCV包膜的广泛抗原变异，未提供中和抗体应答广度的数据，产后中和增强可能窄靶向自体病毒或相似变异株，这或可解释多数控制者最终出现的病毒反弹。此外，研究未使用变异肽直接验证预测CD8?T细胞表位中的氨基酸替换是否在个体内介导免疫逃逸，但表位内替换的富集及与此前两名控制者的详细工作一致性支持产后CD8?T细胞选择的作用。
本研究对妊娠后HCV进化的分析支持产后HCV病毒控制与CD8?T细胞及NAb重新施加的免疫压力相关的假说。结合此前报道的产后病毒控制女性中HCV特异性CD4?T细胞的复苏，这些研究表明慢性感染相关的相互关联的功能障碍免疫应答在部分女性产后早期阶段被逆转。仍需大量工作阐明这种逆转的机制及其在多数女性中未能清除病毒的原因。然而，这些结果具有重要意义，因为它们展示了HCV中已知唯一的有效免疫自发复苏实例。理解这一免疫恢复的自然实验可能为围产期其他免疫介导疾病提供机制和管理方面的见解。此外，这些发现对保护相关性尚未完全明确的HCV疫苗开发，以及免疫耗竭在致病性中发挥作用的多种其他感染和癌症具有启示意义。
