识别依赖性激活的拟南芥RRS1-R/RPS4 TIR-NLR免疫受体对

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Recognition-dependent activation of the Arabidopsis RRS1-R/RPS4 TIR-NLR immune receptor pair

　　

植物TIR结构域蛋白在识别病原菌效应子后表现出NADase活性，产生通过EDS1及其相关蛋白激活防御的小分子。拟南芥RPS4和RRS1构成一个TIR-NLR免疫受体对，识别包括AvrRps4和PopP2在内的多种效应子蛋白。研究人员在此证明，RPS4和RRS1在识别同源效应子后获得NADase活性。然而，在存在和不存在效应子的情况下，RPS4和RRS1均形成一个寡聚体，且该寡聚体的尺寸在提供效应子后不发生改变。RPS4和RRS1的效应子依赖性防御激活需要RPS4的催化谷氨酸残基和BB-loop基序，而该基序在RRS1及拟南芥中其他RRS1样TIR结构域中缺失。RPS4和RRS1的寡聚化通过多个结构域介导，但寡聚化不依赖酶活性。研究人员提出，效应子识别后RPS4/RRS1寡聚体内的构象变化或重构解除了复合物的抑制状态，从而实现免疫激活。

**论文解读：拟南芥RRS1-R/RPS4配对TIR-NLR免疫受体的识别依赖性激活机制**

**一、研究背景与科学问题**

植物先天免疫系统依赖细胞内NLR（核苷酸结合富亮氨酸重复）受体识别病原菌效应子并启动防御反应。TIR-NLR是一类N端含有TIR（Toll/白介素-1受体）结构域的NLR受体，其TIR结构域在效应子识别后通过自身缔合获得NAD?水解酶（NADase）活性，产生信号小分子激活下游EDS1介导的免疫通路。在已解析的激活态TIR-NLR复合物结构中，四个TIR-NLR原聚体以"二聚体的二聚体"构象组装，形成两个NADase活性位点。然而，现有研究主要聚焦于单体TIR-NLR的激活机制，对于配对TIR-NLR——即由一个传感器NLR和一个执行子NLR组成的受体对——如何在效应子识别后启动NADase活性，其分子机制尚不清楚。

拟南芥RRS1-R（传感器）与RPS4（执行子）是研究最为深入的配对TIR-NLR模型。RRS1-R通过其整合的WRKY结构域识别细菌效应子AvrRps4，或通过WRKY结构域的乙酰化修饰识别乙酰转移酶类效应子PopP2。此前研究已表明，RRS1-R可抑制RPS4的自发激活，而效应子识别则解除这种抑制。但RRS1-R/RPS4复合物在激活前后是否发生寡聚状态改变、TIR结构域如何获得NADase活性、以及传感器TIR结构域在复合物中的功能角色，均是悬而未决的核心问题。

**二、研究技术方法与样本来源**

研究人员综合利用多种生化与结构生物学技术：采用蓝绿温和电泳（BN-PAGE）分析蛋白复合物的天然分子量及寡聚状态；通过串联亲和纯化（TAP）结合Flag和Strep/GFP标签系统解析复合物亚基化学计量比；利用εNAD?荧光底物检测纯化复合物的NADase酶活性；结合AlphaFold2/3多聚体结构预测与系统发育分析，对拟南芥全蛋白质组152个TIR结构域进行催化位点和BB-loop保守性评估；通过LC-MS/MS质谱结合MASCOT和DBond软件鉴定复合物内二硫键。样本来源包括野生型及eds1突变体本氏烟（Nicotiana benthamiana）、普通烟（Nicotiana tabacum cv. Petit Gerard）以及稳定转基因拟南芥株系，蛋白质在植物体内通过农杆菌浸润瞬时表达或稳定转基因表达。

**三、主要研究结果**

**（一）RRS1-R/RPS4复合物在效应子依赖性激活后获得NADase活性**

研究人员从eds1突变体本氏烟中共纯化RRS1-R/RPS4复合物，发现仅在共表达同源效应子PopP2时，纯化的复合物才能水解εNAD?底物并产生荧光信号；无效应子共表达的复合物几乎无酶活性。添加ATP不影响NAD?裂解活性，与TIR_RPS4结构域此前的实验结果一致。该结果表明，效应子识别是RRS1-R/RPS4复合物获得NADase活性的必要条件。

**（二）RRS1-R/RPS4复合物在激活前后寡聚状态不变，化学计量比为1:1**

串联亲和纯化实验表明，RRS1-R与RPS4以1:1摩尔比组装成复合物。BN-PAGE分析显示，无论在本氏烟瞬时表达体系还是在稳定转基因拟南芥中，RRS1-R/RPS4复合物均迁移至约720~1,020 kDa位置，且共表达效应子AvrRps4或PopP2不改变复合物的迁移速率。与此形成鲜明对比的是，单体TIR-NLR受体Roq1在效应子XopQ激活后发生明显的迁移 retardation。这表明配对RRS1-R/RPS4与单体TIR-NLR的激活机制存在本质差异：前者在效应子识别后不改变寡聚尺寸，而是在既定复合物内部发生构象重塑。

**（三）TIR结构域NADase活性位点与BB-loop对寡聚化非必需但对免疫激活必需**

RPS4的催化谷氨酸残基（E88）突变为丙氨酸后，RRS1-R/RPS4复合物的寡聚化不受影响，但效应子触发的过敏反应（HR）完全丧失。同样，RPS4的BB-loop基序突变（I48A/D49A/D50A）也不影响寡聚化，但同样消除HR。相比之下，RPS4的NB-ARC结构域P-loop突变（K242A）导致复合物寡聚化丧失。RRS1-R的AE界面突变（S25A/H26A）显著降低复合物的形成效率。这些结果表明：RPS4的TIR催化和底物结合基序仅参与效应子激活下游的NADase功能，而非复合物组装；NB-ARC结构域和TIR结构域AE界面则对复合物形成起关键作用；NADase活性与寡聚化是两个可分离的功能层面。

**（四）传感器NLR的TIR结构域普遍缺失NADase活性相关基序**

序列与结构比对显示，RRS1-R的TIR结构域缺乏催化谷氨酸残基，BB-loop较短且缺少保守天冬氨酸。研究人员对拟南芥Col-0蛋白质组中152个TIR结构域进行系统发育分析，发现一个包含多个配对TIR-NLR传感器NLR的进化分支，其TIR结构域均缺失催化谷氨酸或BB-loop天冬氨酸。相反，配对TIR-NLR中的执行子NLR则完整保留这两个关键基序。该结果揭示了配对TIR-NLR的一个普遍特征：传感器TIR结构域的NADase活性退化可能是抑制复合物自发激活的重要机制。

**（五）多个结构域共同维持复合物寡聚化，LRR结构域C783参与激活**

P-loop突变和AE界面突变均导致复合物寡聚化丧失，而NB-ARC结构域的自发激活突变（RPS4 S270F、RRS1-R slh1）则不改变复合物在BN-PAGE上的迁移行为。通过LC-MS/MS结合AlphaFold3预测，研究人员鉴定出多个候选分子内二硫键，其中RPS4 C783的丙氨酸或丝氨酸突变均导致效应子依赖性HR丧失，且该突变使复合物寡聚化消失。C783位于LRR结构域保守基序内，且在多种TIR-NLR中高度保守，提示该残基可能参与复合物的结构稳定或激活态构象的维持。其他候选二硫键位点（RRS1-R C289/C291、RPS4 C1001/C1006）的突变不影响复合物形成和HR。

**（六）AlphaFold3预测揭示效应子激活后TIR结构域重排方向**

AlphaFold3多聚体结构预测表明，单独的TIR_RPS4或TIR_RRS1结构域不能组装成Roq1同源四聚体构象，但加入NAD?后TIR_RPS4可形成Roq1样同源四聚体。当TIR_RPS4与TIR_RRS1各两份共同建模时，4/5的预测模型呈现异源二聚体的二聚体组装，形成异源BE界面；加入NAD?后，最优模型显示两个TIR_RPS4形成同源BE界面，从而在异源四聚体内部构建出具备NADase活性的活性位点。

**四、讨论与结论**

本研究揭示了配对TIR-NLR受体激活的全新机制。RRS1-R与RPS4在静息状态下即以1:1化学计量比预组装为稳定的异源寡聚复合物，效应子识别不改变复合物的尺寸和化学计量比，而是在预成复合物内部触发TIR结构域的重构：RPS4的TIR结构域从传感器RRS1-R TIR结构域的抑制中释放，并通过同源BE界面形成具备NADase活性的二聚体构象。传感器TIR结构域在进化上普遍丢失NADase催化残基，这可能是防止复合物自发激活的重要安全保障，同时也为从基因组中识别新的配对TIR-NLR提供了分子特征。该"预组装-构象去抑制"机制使配对NLR能够在效应子感知后绕过单体NLR需要招募三个额外激活单体形成四聚体的步骤，从而更高效地启动免疫防御，也为作物抗病育种中配对NLR的工程化改造提供了理论指导。