应激诱导WASF3经内质网-线粒体界面抑制脑氧化代谢并损害认知功能

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Stress-inducible WASF3 regulates brain metabolism and cognitive function

　　

Wiskott–Aldrich综合征蛋白家族成员3（WASF3）可破坏线粒体呼吸，并在肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征（ME/CFS）中伴随内质网（ER）应激而被诱导。由于认知功能障碍是ME/CFS的标志，研究人员利用WASF3转基因和敲除小鼠模型研究了WASF3在脑代谢和功能中的作用。WASF3破坏呼吸复合体IV（complex IV）并定位于线粒体相关膜（MAMs），后者已知可调控对神经元活动重要的细胞过程。在海马（记忆形成的关键区域）中过表达WASF3可诱导代谢向糖酵解转变并促进“低代谢”状态。WASF3增加还导致ATP酶抑制因子1（ATPIF1）减少，而ATPIF1此前已被证明可促进认知功能，并损害学习。相反，WASF3缺失增加ATPIF1水平、增强氧化代谢并在应激下保持认知功能。总之，这些发现表明WASF3抑制脑内氧化代谢并导致认知功能障碍，为ME/CFS中所报告的“脑雾”提供了机制见解。

研究背景：肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征（ME/CFS）是一种多系统慢性疾病，估计影响约1%人口，表现为持续疲劳、运动后不适（PEM）、免疫异常、睡眠不解乏以及多种认知和自主神经损害，目前缺乏特异性治疗。其认知症状常被称为“脑雾”，复杂且可能比躯体症状更致残；身体或精神应激后注意力和记忆等显著恶化构成PEM，提示脑参与其中。ME/CFS发病机制尚未充分明确，但线粒体功能障碍证据持续存在。研究人员此前发现，内质网（ER）应激诱导的Wiskott–Aldrich综合征蛋白家族成员3（WASF3）介导ME/CFS骨骼肌线粒体功能障碍，但其在脑代谢和功能中的作用未知。因此，研究人员利用遗传小鼠模型研究WASF3对脑线粒体代谢和认知的影响，发现WASF3升高破坏线粒体功能、诱导低代谢状态并损害学习，而降低WASF3可增强氧化代谢标志并保护应激下认知功能；这连接了ER应激与脑生物能量障碍，提示靶向ER应激-WASF3信号可能缓解ME/CFS及相关病毒感染后疲劳障碍的认知症状。

关键技术方法：研究人员使用WASF3转基因（B6D2F1/J）、CRISPR/Cas9 WASF3^?/?（C57BL/6）、WASF3^fl/fl（C57BL/6，JAX #033353）与CMV-Cre（C57BL/6J，JAX #006054）小鼠及C2C12细胞（ATCC）；采用免疫印迹、免疫组化、亚细胞分级分离（MAMs/线粒体/ER/胞质）、蓝白非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）与细胞色素c氧化酶（COX）活性、四甲基罗丹明乙酯（TMRE）膜电位、时空图像相关光谱（STICS）线粒体运动、海马Seahorse耗氧率（OCR）/细胞外酸化率（ECAR）、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）代谢组学及恐惧条件化、Morris水迷宫（MWM）、旷场行为学。未涉及人类样本队列。

研究结果：
1. WASF3升高破坏线粒体功能并损害认知。在C2C12细胞中过表达全长WASF3导致线粒体膜电位（ΔΨ_m）丢失和肌动蛋白依赖的定向线粒体运动下降；删除C端肌动蛋白相互作用域的WASF3ΔC消除其对定向线粒体运动的抑制，但不影响其对呼吸复合体IV（CIV；MTCO1）和ΔΨ_m的抑制。纯化线粒体和脑组织免疫印迹显示，WASF3过表达降低MTCO1和ATP酶抑制因子1（ATPIF1；线粒体ATP合酶调节亚基），增加即刻早期反应3（IER3，又称IEX1）及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）激活磷酸化；WASF3转基因小鼠脑组织ATPIF1和MTCO1降低。恐惧条件化显示WASF3转基因小鼠冻结时间减少，尤其线索性恐惧条件化；雌性转基因小鼠在MWM中表现缺陷，雄性转基因小鼠旷场自发运动和探索活动降低。结论是WASF3过表达可通过影响线粒体代谢和ΔΨ_m损害认知相关行为，并呈性别依赖行为改变。

2. WASF3调控脑代谢和应激反应信号。利用CRISPR/Cas9构建的WASF3^?/?小鼠未见明显发育或形态异常；免疫组化显示WASF3在脑内广泛表达并有区域差异，海马锥体神经元和小脑浦肯野细胞信号较强。WASF3缺失降低p38磷酸化，增加ATPIF1和MTCO1，降低糖酵解限速酶果糖磷酸激酶肝型（PFKL），增加PKM1及活性四聚体PKM2。海马组织在无糖条件下，WASF3转基因样本耗氧率（OCR）降低，WASF3^?/?样本OCR增加，转基因样本细胞外酸化率（ECAR）呈升高趋势。亚细胞分级分离显示WASF3主要位于ER，也见于线粒体和ATAD3阳性MAMs；多柔比星（Dox）处理增加ER应激标志磷酸化PERK、WASF3并降低MTCO1。BN-PAGE显示WASF3与线粒体呼吸超复合体CIII₂+IV共迁移，并剂量依赖降低MTCO1和COX活性。海马代谢组学显示转基因样本代谢物总体降低、WASF3缺失样本反向；雌性转基因小鼠糖酵解中间体果糖1,6-二磷酸降低，WASF3缺失样本糖酵解中间体升高，辅酶A（CoA）在缺失状态升高而在过表达状态降低；三羧酸（TCA）循环中间体大多不变，琥珀酸例外；雌性转基因小鼠β氧化和膜脂代谢物降低，缺失样本升高β-羟基丁酸（BHBA）；转基因小鼠积累极长链溶血磷脂酰胆碱1-lignoceroyl-GPC（24:0），雄性转基因小鼠中链二羧酸积累；4-咪唑乙酸（IAA）和leucylalanine呈反向变化。结论是WASF3作为脑线粒体活性负调控因子，促进ME/CFS样低代谢状态并具性别依赖效应。

3. WASF3下调防止认知损伤。CRISPR/Cas9 WASF3^?/?小鼠在恐惧条件化中与野生型相似；CMV-Cre WASF3^fl/fl小鼠较CMV-Cre WASF3^+/+小鼠线索性恐惧条件化改善，而Cre本身损害恐惧条件化。Cre表达海马出现p38磷酸化、p53和IEX1升高及ATPIF1降低；在WASF3可变缺失小鼠中，ATPIF1与MTCO1水平同WASF3丰度显著负相关。8周自愿跑轮运动降低脑内磷酸化PERK、WASF3和磷酸化p38，并增加MTCO1和ATPIF1。结论是WASF3缺失在正常条件下不影响恐惧条件化，但可减轻Cre对线索性恐惧条件化的不良影响；遗传和生理性下调WASF3均支持其通过破坏线粒体呼吸、脂肪酸氧化（FAO）及降低ATPIF1介导认知损伤。

讨论部分总结：讨论指出，WASF3不仅是骨骼肌中ER应激诱导的线粒体功能障碍介质，也在脑内作为氧化代谢负调控因子影响认知；WASF3升高与线粒体下调、代谢向糖酵解偏移及关联学习损害相关，降低WASF3则增加氧化代谢标志并在细胞应激下防止认知下降。WASF3定位于ER-线粒体界面，与其受ER应激稳定并直接调控线粒体功能相符；MAMs参与脂质合成转运和Ca²⁺稳态，对突触功能重要。ATPIF1是WASF3调控脑生物能量和功能的重要因子，WASF3过表达降低ATPIF1，WASF3降低则增加ATPIF1；在呼吸受损时下调ATPIF1可能是维持ΔΨ_m和Ca²⁺稳态、防止神经元死亡的代偿机制。WASF3可激活p38和p53，二者可诱导IEX1并促进ATPIF1降解。线粒体功能障碍尤其CIV破坏可通过生物能量和信号机制影响认知；WASF3转基因小鼠脑WASF3中度升高至与Dox诱导相当水平，线粒体活性降低约50%，基础代谢组改变类似ME/CFS。WASF3相关代谢组改变在雌性小鼠更明显，与ME/CFS女性患病率较高平行，并可能与雌性转基因小鼠MWM空间学习记忆选择性损害有关。作者提出WASF3是ME/CFS及其他病毒感染后慢性疲劳综合征如Long COVID中多系统异常（包括认知障碍）的线粒体功能障碍介质，并提示抑制ER应激可能改善ME/CFS患者线粒体功能障碍和认知症状。

研究结论（译）：WASF3抑制脑内氧化代谢并导致认知功能障碍，为ME/CFS中所报告的“脑雾”提供机制见解；WASF3过表达在体内产生以糖酵解中间体降低和FAO底物积累为主的稳态代谢组学图像，与ME/CFS中报道的低代谢综合征一致；WASF3相关代谢组改变在雌性小鼠中更明显，与ME/CFS女性患病率较高平行，并可能与雌性WASF3转基因小鼠MWM空间学习记忆选择性损害有关；这些观察突出WASF3作为线粒体功能障碍介质，可能构成ME/CFS或其他病毒感染后慢性疲劳综合征如Long COVID中所见包括认知障碍在内的多系统异常的基础。